br>[0020] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述制備含有豬偽狂犬病毒變異株的液體使用細(xì)胞 懸浮培養(yǎng)方法制備豬偽狂犬病毒。
[0021] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述制備含有豬偽狂犬病毒變異株的液體使用微載 體作為細(xì)胞載體以制備豬偽狂犬病毒。
[0022] 所述"易感的動(dòng)物細(xì)胞"可以是傳代細(xì)胞系，也可以是原代細(xì)胞。適合于豬偽狂 犬病毒的易感細(xì)胞包括但不限于，ST細(xì)胞系（ATCC編號(hào)：CRL-1746)、PK-15細(xì)胞系（ATCC 編號(hào)：CCL-33)、非洲綠猴腎細(xì)胞Marc-145細(xì)胞系（ATCC編號(hào)：CRL-12219)、牛腎細(xì)胞MDBK 細(xì)胞系（ATCC編號(hào)：CCL-22)、牛睪丸傳代細(xì)胞BT細(xì)胞系（ATCC編號(hào)：CRL-1390)、Vero細(xì) 胞系（ATCC編號(hào)：CCL-81)、BHK-21細(xì)胞系（ATCC編號(hào)：CCL-10)、豬腎傳代細(xì)胞系（如： IBRS-2,見(jiàn)例如，DECASTRO，M.P. 1964.Behavioroffootandmouthdiseasevirusin cellculturesusceptibilityoftheIB-RS-2swinecellline.ArquivosInstituto Biologica31 :63-78)、兔腎傳代細(xì)胞系（RK，如：ATCC編號(hào)：CCL-106)等傳代細(xì)胞系，或者 雞胚成纖維細(xì)胞和豬腎細(xì)胞等原代細(xì)胞。原代細(xì)胞可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法，用動(dòng)物體 內(nèi)的組織進(jìn)行分離和制備。優(yōu)選地，所述的適合的動(dòng)物細(xì)胞為BHK-21細(xì)胞系。
[0023] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式所述的"提供含有豬偽狂犬病毒的液體"為采用BHK21 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法來(lái)增殖偽狂犬病毒。
[0024] 作為本發(fā)明的另外一種實(shí)施方式所述的"提供含有豬偽狂犬病毒的液體"為采用 PK15細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法來(lái)增殖偽狂犬病毒。
[0025] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明所述制備方法中所述步驟（1)之后步驟（2) 之前還可以包括澄清、濃縮所述含有豬偽狂犬病毒的液體的步驟；例如通過(guò)膜過(guò)濾進(jìn)行將 病毒液濃縮為原體積的1/2至1/5。
[0026] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述步驟（1)之后還包括滅活病毒的步驟。
[0027] 病毒滅活對(duì)于本發(fā)明的制備方法是必須的，可以通過(guò)化學(xué)或者物理的方法實(shí)現(xiàn)滅 活，例如，物理方法的加熱，化學(xué)方法的加入甲醛、二乙烯亞胺（BEI)或0丙內(nèi)酯一個(gè)優(yōu)選 實(shí)施方式所用的滅活劑為甲醛。
[0028] 病毒滅活步驟可以選擇步驟（1)滅活，也可以選擇在步驟（3)中除去的非離子表 面活性劑后滅活。
[0029] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述步驟（2)中非離子表面活性劑包括烷基葡糖 苷、Brij35、Brij58、Genapol、TritonX-100、TritonX-114、吐溫 20、吐溫 80、Nonidet P40、脫氧膽酸鈉。
[0030] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟（2)中非離子表面活性劑為Triton X-114、NonidetP40。
[0031] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述步驟（2)中非離子表面活性劑加入的量為與所 述滅活的豬偽狂犬病毒的液體體積比〇. 1% -5%。
[0032] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，非離子表面活性劑加入的量為與所述滅活的豬 偽狂犬病毒的液體體積比〇. 5%?2. 5%。
[0033] 上述步驟（b)所述非離子表面活性劑非離子表面活性劑的加入量有嚴(yán)格限制， 量多會(huì)造成有效蛋白的損失，加入量太小則無(wú)法去除雜質(zhì)蛋白。非離子表面活性劑量為 滅活的豬偽狂犬病毒的液體與非尚子表面活性劑體積比為〇. 1 % _5 %，優(yōu)選的范圍為 0. 1% -0.2 %,0.2 % -0.3 %,0.3 % -0.4 %,0.4 % -0.5 %,0.5 % -0.6 %,0.6 % -0.7%, 0. 7 % -0. 8 %,0. 8 % -0. 9%,0.9-1. 0 %,0. 8 % -〇. 9 %,0. 9 % -1. 0 %U. 0 % -1. 1 %> 1. 1% -1.2 %U. 2 % -1.3 %U. 3 % -1.4 %,1. 4 % -1.5 %U. 5 % -1.6 %U. 6 % -1.7%, 1. 7 % -1. 8 %,1. 8 % -1. 9 %,1. 9 % -2. 0 %,2. 0% -2. 5 %,2. 5 % -3. 0 %,3. 0% -3. 5%, 3. 5% -4. 0%、4. 0% -4. 5%或 4. 5% -5. 0%。最優(yōu)選為 0? 5%、1%、2. 5%。
[0034] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述步驟（2)中增溶處理為在非離子表面活性劑與 水不互溶的溫度下混勻、溶解處理30分鐘以上。
[0035] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟（2)中增溶處理為在0°C_5°C混勻、溶 解處理60分鐘。
[0036] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述步驟（3)除去非離子表面活性劑的步驟為在 10-30°C或37°C+0? 5°C離心，所述離心的離心力大于100,000g。
[0037] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述步驟（3)還包括除去病毒粒子的步驟。
[0038] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述步驟（3)中除去非離子表面活性劑和病毒粒子 可以同時(shí)進(jìn)行，也可以分步進(jìn)行。
[0039] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟（3)中除去非離子表面活性劑和病毒 粒子的步驟中，所述離心的離心力大于200,000g，離心2小時(shí)以上，以同時(shí)除去病毒粒子。
[0040] 本發(fā)明的第二方面為提供一種上述方法制備的所述的疫苗組合物，其中，所述疫 苗組合物中含有所述純化的豬偽狂犬病毒抗原5yg/頭份-500yg/頭份以及藥學(xué)上可以 接受的載體，優(yōu)選地含有抗原10yg/頭份-100yg/頭份，最優(yōu)選為25yg/頭份。
[0041] 本發(fā)明疫苗可以按照公知常識(shí)加入藥學(xué)上可以接受的載體，例如穩(wěn)定劑、稀釋劑、 防腐劑，和緩釋劑，稀釋包括水、右旋糖酐、乙醇等諸如此類，等滲劑包括氯化鈉、甘露醇、乳 糖等諸如此類。穩(wěn)定劑包括白蛋白，防腐劑包括硫柳汞、抗生素等諸如此類。
[0042]作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，疫苗組合物還包括佐劑，所述佐劑包括鋁膠佐劑、 皂苷、含皂苷的免疫刺激性組合物、油包水乳劑、水包油乳劑、水包油包水乳劑、丙烯酸、 甲基丙烯酸的聚合物、順丁烯二酸酐和鏈烯基衍生物的共聚物、RIBI佐劑系統(tǒng)、Block c〇-polymer、SAF-M、單磷酰脂質(zhì)A、Avridine脂質(zhì)-胺佐劑、大腸桿菌不耐熱腸毒素、霍亂毒 素、IMS1314、胞壁酰二肽或Gel佐劑中的一種或幾種。
[0043] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式所述佐劑為"免疫刺激性復(fù)合物"。
[0044] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述含皂苷的免疫刺激性組合物為皂苷與固醇及磷 脂的組合物，其中阜苷對(duì)固醇及磷脂的比例為1 :l〇〇(w/w)至5 :l(w/w)。
[0045] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述含皂苷的免疫刺激性組合物為皂苷與固醇 及磷脂的組合物，其中阜苷對(duì)固醇及磷脂的比例為1 : 2(w/w)至1 : 5(w/w)。
[0046] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述含皂苷的免疫刺激性組合物中皂苷的量為 0? 05mg/頭份至0? 2mg/頭份。
[0047] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述含皂苷的免疫刺激性組合物中皂苷的量為 0?lmg/ 頭份。
[0048] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，在上述四種實(shí)施方式中，所述含皂苷的免疫刺 激性組合物為QuilA與膽固醇及卵磷脂的組合物。
[0049] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述佐劑分別為含皂苷的免疫刺激性組合物和卡波 姆、QuilA與鋁膠的組合物。
[0050] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，含皂苷的免疫刺激性組合物和卡波姆的佐劑組 合物中，含皂苷的免疫刺激性組合物為皂苷QuilA與膽固醇及卵磷脂的組合物，含量為 QuilA0.lmg/頭份，膽固醇0. 2mg/頭份，卵磷脂0. 2mg/頭份，卡波姆含量為2mg/頭份。
[0051] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，QuilA與鋁膠的組合物中，QuilA含量為 50-70yg/頭份，鋁膠含量為占疫苗組合物體積10-20%。
[0052] 術(shù)語(yǔ)"免疫刺激性復(fù)合物"或ISC0M是指當(dāng)QuilA與固醇及磷脂組合時(shí)形成的特 殊形式。ISC0M可通過(guò)組合皂苷、固醇及磷脂來(lái)制備。例如：ISC0M可含有以重量計(jì)5%至 10%的QuilA、l%至5%的膽固醇和磷脂，以及剩余部分的蛋白質(zhì)。佐劑配制物中皂苷對(duì) 固醇的比例典型地為1 : 1〇〇(重量對(duì)重量）（w/w)至5 :l(w/w)。在一些實(shí)施方案中存 在過(guò)量的固醇，