一種新的治療肺癌的Der p1納米疫苗及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及新型疫苗發(fā)明領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種新的治療肺癌的Derpi納米疫苗 及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)所有癌癥發(fā)病率的首位，其五年存活率大約為15%，約 30-40%的肺癌患者發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，一旦發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，其中位生存時(shí)間只有7個(gè)月。美國(guó)2012 年肺癌有超過(guò)163萬(wàn)新發(fā)病例及57萬(wàn)死亡病例。肺癌同時(shí)也超過(guò)肝癌成為了我國(guó)第一大 高發(fā)癌癥，且發(fā)病率及死亡率增長(zhǎng)最為迅速，每年以13%的速度增長(zhǎng)。目前，肺癌占據(jù)癌癥 發(fā)病率排行(男女綜合）的首位，其中在男性發(fā)病率中排第一，在女性癌癥發(fā)病率中也始終 排在前三位。預(yù)計(jì)到2025年，中國(guó)每年新增肺癌病例將超過(guò)100萬(wàn)例。肺癌患者還呈現(xiàn)年 輕化趨勢(shì)，尤其是近幾年來(lái)，45歲以下的肺癌患者多有出現(xiàn)。因此，肺癌已經(jīng)嚴(yán)重影響威脅 我國(guó)人民的生命健康。
[0003]目前治療方法主要有手術(shù)治療、化療、放療等方法?？v觀目前的療法，手術(shù)治療主 要適合早中期（i~ii期）肺癌和腫瘤局限在一側(cè)胸腔的部分選擇性的mb期肺癌，和放療 同屬局部治療，從腫瘤生物學(xué)角度看，癌癥是全身性疾病，存在轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散的特性；常規(guī)的 放療和化療等治療方式，在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也損傷機(jī)體正常細(xì)胞和免疫系統(tǒng)，降低免 疫力，毒副作用大。因此，開(kāi)展新的抗癌藥物的研發(fā)重要且必要，尋找對(duì)抗癌效果好且對(duì)正 常組織毒害小、不損害機(jī)體免疫的藥物的確迫切需求。經(jīng)過(guò)我們發(fā)明人前期研究表明，屋塵 螨Derpi疫苗對(duì)肺癌的治療有著顯著的作用，且能增強(qiáng)機(jī)體免疫能力，具有抗癌功能。
[0004] 本發(fā)明采用基因工程技術(shù)在大腸桿菌中克隆和表達(dá)制備重組Derpi蛋白，克服了 從螨體中大量提取的困難。同時(shí)采用PLGA納米佐劑制備塵螨重組變應(yīng)原Derpi疫苗，用 于治療肺癌。本發(fā)明國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的之一是克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，而提供一種新的治療肺癌的Der pl納米疫苗。
[0006] 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明上述發(fā)明目的的技術(shù)方案是：一種新的治療肺癌的Derpl納米疫苗， 其是采用如下步驟制備而成的： 步驟一，用基因工程技術(shù)制備重組屋塵螨變應(yīng)原Derpl: (1)挑取單個(gè)含重組表達(dá)質(zhì)粒重組pET-24a(+)Derpl的基因工程菌菌落接種于含 50iig/ml卡那霉素的LB中，35~37°C，160~240rpm搖菌過(guò)夜，按1~4%的接種量將基因工程 菌菌落接種于LB/kam培養(yǎng)液中，200~300rpm搖菌至0D600為0. 5~0. 7時(shí)，加入IPTG使其 終濃度為〇.l~〇. 4mM，誘導(dǎo)4~6小時(shí)后，2000~4000g在2~6°C離心5~15min，去上清，沉淀用 lxPBS洗滌，將細(xì)菌重懸于40mllxPBS/5mMEDTA中，加入溶菌霉至終濃度0. 4~0. 6mg/ml， DIT至終濃度 5~15mM，PMSF至終濃度 0? 8~1. 2mmol/L，TritonX-100 至終濃度 0? 8~1. 2%， 并于室溫中振蕩20~40分鐘，制成基因工程菌培養(yǎng)物裂解液，-80°C保存； (2) 將裂解液置于冰浴下40W超聲5~15遍，超聲20~40s、停20~40s，直至菌體不粘為 止，10000~12000g3~5°C離心10~20min，去上清，得基因工程菌包涵體； (3) 在冰浴下，用100ml包涵體洗液1重懸沉淀，并磁力攪拌20~40min, 10000~12000g3~5°C離心10~20min，去上清，再依次用包涵體洗液2和包涵體洗液3重懸， 冰浴磁力攪拌，離心去上清，最后將沉淀溶于20ml包涵體溶解液中，10000~12000g離心 30min，棄沉淀，得包涵體； 由于重組蛋白N-端帶有6-His標(biāo)簽，故通過(guò)Ni2+金屬螯合層析進(jìn)行重組Derpi親和 層析純化，得重組屋塵螨變應(yīng)原Derpi; 步驟二，制備PLGA-塵螨應(yīng)變?cè)璂erpi(PLGA-Derpi)納米疫苗： 稱50mgPLGA溶于二氯甲烷中，再加入100iiL已制備好的濃度為100mg/ml的重組屋塵 螨應(yīng)變?cè)璂erpl，混旋lmin，40w，超聲乳化1min形成初乳液，再加入2ml濃度為2%的聚 乙烯醇（PVA)，再超聲乳化1~2min，形成復(fù)乳液，然后將復(fù)乳液轉(zhuǎn)移至50ml的雙蒸水中，室 溫下攪拌3~5h，使有機(jī)溶劑充分揮發(fā)，lOOOOrpm/min離心lOmin，離心收集微粒，再用雙蒸 水洗滌，最后真空冷凍干燥成微粒粉末狀的PLGA-塵螨變應(yīng)原Derpi納米疫苗，4°C保存。
[0007] 優(yōu)選地，所述步驟一（1)中的基因工程菌菌落接種量為2%;搖菌至終濃度為 0? 2mM;PMSF至終濃度為lmmol/L;TritonX-100 至終濃度為 1%。
[0008] 優(yōu)選地，所述步驟一（3)中的包涵體洗液1為50mmol/LPBPH8.0，100mmol/L Nacl，5mmol/LEDTA;包涵體洗液 2 為 50mmol/LPBPH8.0，100mmol/LNacl，5mmol/LEDTA， 2%TritonX-100;包涵體洗液 3 為 50mmol/LPBPH8.0，100mmol/LNacl，5mmol/LEDTA， 4mol/L尿素；包涵體溶解液為 50mmol/LPBPH8. 0,300mmol/LNacl，20mmol/L咪唑，6mol/ L尿素。
[0009]優(yōu)選地，所述步驟二中的PLAG為L(zhǎng)A:GA=65:35,Mw=40000-75000。
[0010] 本發(fā)明的目的之二是克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，而提供一種新的治療肺癌的Der pl納米疫苗的制備方法。
[0011] 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明上述發(fā)明目的的技術(shù)方案是：一種新的治療肺癌的Derpl納米疫苗 的制備方法，其步驟如下： 步驟一，用基因工程技術(shù)制備重組屋塵螨變應(yīng)原Derpl: (1) 挑取單個(gè)含重組表達(dá)質(zhì)粒重組pET-24a(+)Derpl的基因工程菌菌落接種于含 50iig/ml卡那霉素的LB中，35~37°C，160~240rpm搖菌過(guò)夜，按1~4%的接種量將基因工程 菌菌落接種于LB/kam培養(yǎng)液中，200~300rpm搖菌至0D600為0. 5~0. 7時(shí)，加入IPTG使其 終濃度為〇.l~〇. 4mM，誘導(dǎo)4~6小時(shí)后，2000~4000g在2~6°C離心5~15min，去上清，沉淀用 lxPBS洗滌，將細(xì)菌重懸于40mllxPBS/5mMEDTA中，加入溶菌霉至終濃度0. 4~0. 6mg/ml， DIT至終濃度 5~15mM，PMSF至終濃度 0? 8~1. 2mmol/L，TritonX-100 至終濃度 0? 8~1. 2%， 并于室溫中振蕩20~40分鐘，制成基因工程菌培養(yǎng)物裂解液，-80°C保存； (2) 將裂解液置于冰浴下40W超聲5~15遍，超聲20~40s、停20~40s，直至菌體不粘為 止，10000~12000g3~5°C離心10~20min，去上清，得基因工程菌包涵體； (3) 在冰浴下，用100ml包涵體洗液1重懸沉淀，并磁力攪拌20~40min, 10000~12000g3~5°C離心10~20min，去上清，再依次用包涵體洗液2和包涵體洗液3重懸， 冰浴磁力攪拌，離心去上清，最后將沉淀溶于20ml包涵體溶解液中，10000~12000g離心 30min，棄沉淀，得包涵體； 由于重組蛋白N-端帶有6-His標(biāo)簽，故通過(guò)Ni2+金屬螯合層析進(jìn)行重組Derpi親和 層析純化，得重組屋塵螨變應(yīng)原Derpi; 步驟二，制備PLGA-塵螨應(yīng)變?cè)璂erpi(PLGA-Derpi)納米疫苗： 稱50mgPLGA溶于二氯甲烷中，再加入100iiL已制備好的濃度為100mg/ml的重組屋塵 螨應(yīng)變?cè)璂erpl，混旋lmin，40w，超聲乳化1min形成初乳液，再加入2ml濃度為2%的聚 乙烯醇（PVA)，再超聲乳化1~2min，形成復(fù)乳液，然后將復(fù)乳液轉(zhuǎn)移至50ml的雙蒸水中，室 溫下攪拌3~5h，使有機(jī)溶劑充分揮發(fā)，lOOOOrpm/min離心lOmin，離心收集微粒，再用雙蒸 水洗滌，最后真空冷凍干燥成微粒粉末狀的PLGA-塵螨變應(yīng)原Derpi納米疫苗，4°C保存。
[0012] 優(yōu)選地，所述步驟一（1)中的基因工程菌菌落接種量為2%;搖菌至終濃度為 0? 2mM;PMSF至終濃度為lmmol/L;TritonX-100 至終濃度為 1%。
[0013] 優(yōu)選地，所述步驟一（3)中的包涵體洗液1為50mmol/LPBPH8. 0，100mmol/L Nacl，5mmol/LEDTA;包涵體洗液 2 為 50mmol/LPBPH8.0，100mmol/LNacl，5mmol/LEDTA， 2%TritonX-100;包涵體洗液 3 為 50mmol/LPBPH8.0，100mmol/LNacl，5mmol/LEDTA， 4mol/L尿素；包涵體溶解液為 50mmol/LPBPH8. 0,300mmol/LNacl，20mmol/L咪唑，6mol/ L尿素。
[0014]優(yōu)選地，所述步驟二中的PLAG為L(zhǎng)A:GA=65:35,Mw=40000-75000。
[0015] 本發(fā)明的目的之三是克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，而提供一種新的治療肺癌的Der pl納米疫苗的用途。
[0016] 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明上述發(fā)明目的的技術(shù)方案是：一種新的治療肺癌的Derpl納米疫苗， 用于治療肺癌。
[0017] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明的一種新的治療肺癌的Derpl納 米疫苗，具有良好的抗癌功能，對(duì)肺癌有著顯著的治療效果，既對(duì)人體無(wú)毒害作用，還能增 加機(jī)體免疫能力，且制備工藝簡(jiǎn)單。
[0018] 以下通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 實(shí)施例1 : 一種新的治療肺癌的Derpl納米疫苗，其是采用如下步驟制備而成的： 步驟一，用基因工程技術(shù)制備重組屋塵螨變應(yīng)原Derpl: (1)挑取單個(gè)含重組表達(dá)質(zhì)粒重組pET-24a(+)Derpl的基因工程菌菌落接種于20ml含50iig/ml卡那霉素的LB中，35°C，160rpm搖菌過(guò)夜，按1%的接種量將基因工程菌菌 落接種于1LLB/kam培養(yǎng)液中，200rpm搖菌至0D600為0. 5時(shí)，加入IPTG使其終濃度為 0.ImM，誘導(dǎo)4小時(shí)后，2000g在2°C離心5min，去上清，沉淀用lxPBS洗滌一遍，將細(xì)菌重懸 于40mllxPBS/5mMEDTA中，加入溶菌霉至終濃度0. 4mg/ml，DTT至終濃度5mM，PMSF至終 濃度0. 8mmol/L，TritonX-100至