一種用于上呼吸道感染的復(fù)合抗體口腔噴劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種口腔噴劑,具體涉及一種用于上呼吸道感染的復(fù)合抗體口腔噴劑 及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 上呼吸道感染簡(jiǎn)稱(chēng)上感,又稱(chēng)感冒,發(fā)生率較高,成人每年發(fā)生2?4次,兒童發(fā) 生率更高,每年6?8次。全年皆可發(fā)病,冬春季較多。上呼吸道感染有70%?80%由病毒 引起。包括鼻病毒、冠狀病毒、腺病毒、流感病毒和副流感病毒、呼吸道合胞病毒、??刹《?、 柯薩奇病毒等。另有20%?30%的上感由細(xì)菌引起。細(xì)菌感染可直接感染或繼發(fā)于病毒 感染之后,以溶血性鏈球菌為最常見(jiàn),其次為流感嗜血桿菌、肺炎球菌、葡萄球菌等,偶或?yàn)?革蘭陰性細(xì)菌。各種導(dǎo)致全身或呼吸道局部防御功能降低的原因,如受涼、淋雨、氣候突變、 過(guò)度疲勞等可使原已存在于上呼吸道的或從外界侵入的病毒或細(xì)菌迅速繁殖,從而誘發(fā)呼 吸道感染。老幼體弱,免疫功能低下或患有慢性呼吸道疾病的患者易感。
[0003] 廣譜抗菌劑氯已定又名洗必泰(Chlorhexidine)對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌比陰性菌的抗 菌作用強(qiáng),比季銨鹽類(lèi)陽(yáng)離子表面活性劑強(qiáng),對(duì)真菌也有效,對(duì)組織無(wú)刺激性,被廣泛地用 于皮膚消毒,沖洗傷口及手術(shù)器械的浸泡及消毒。
[0004] 大多數(shù)中和抗體在體內(nèi)與體外一樣具有結(jié)合病毒并使病毒感染力減弱的能力,作 用機(jī)制主要包括:1.通過(guò)凝集病毒,使病毒的結(jié)構(gòu)失穩(wěn),抑制病毒對(duì)靶細(xì)胞的吸附;2.抑制 病毒與靶細(xì)胞的黏附;3.阻止病毒侵入靶細(xì)胞;4.抑制病毒侵入后的效應(yīng)。
[0005] 噴劑為氣壓制劑,一般以局部應(yīng)用為主,噴射的霧滴比較粗,但可以滿(mǎn)足臨床的需 要。以壓縮空氣作動(dòng)力,其噴出的微粒大小約在20?60 μ m,當(dāng)人體吸入后能達(dá)到末端支氣 管;以惰性氣體作動(dòng)力噴出的微粒大小為10 μ m以下,吸入后可達(dá)到肺部深處。適合用于肺 部吸入或直接噴至腔道黏膜、皮膚及空間消毒的制劑。
[0006] 目前,市場(chǎng)上還沒(méi)有既可以抵抗病毒又可以抵抗細(xì)菌的特效藥物。一般情況下, 氯已定能與蛋白結(jié)合而降低活性,也忌與生物學(xué)上常用的生理鹽水、磷酸鹽、碳酸鹽、硼酸 鹽等接觸,因可生成而沉淀而降低其活性。由于這些原因,限制了氯已定與其他生物活性配 伍使用機(jī)會(huì)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 本發(fā)明要解決的問(wèn)題是,通過(guò)改進(jìn)配方和制備工藝成功實(shí)現(xiàn)了氯已定與具有抗 病毒功效的特異抗體配伍,起到協(xié)同作用,比各自單獨(dú)使用效果更好,可用于預(yù)防上呼吸道 病毒及細(xì)菌的感染和傳播。
[0008] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題,本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種用于上呼吸道感染的復(fù)合 抗體口腔噴劑,所述噴劑的成分包括:抗流感病毒抗體、抗致病菌抗體和氯已定。
[0009] 優(yōu)選的,所述抗流感病毒抗體和抗致病菌抗體的含量按效價(jià)計(jì)均為100-50000滴 度,優(yōu)選的,效價(jià)為1000-10000滴度。
[0010] 優(yōu)選的,所述氯已定的含量為0.001 %-I % (w/v),優(yōu)選的,含量為0.01 %-o. I % (w/v)〇
[0011] 優(yōu)選的,所述噴劑的成分還包括:
[0012] (1)磷酸鹽緩沖液:終濃度為5-200mM,pH值為6-8. 5 ;
[0013] (2)聚乙二醇:終濃度 1% -10% (w/v);
[0014] (3)香精:終濃度 0· 001% -0· 5% (v/v)。
[0015] -種制備用于上呼吸道感染的復(fù)合抗體口腔噴劑的方法,包括如下步驟:
[0016] (1)取適量抗體原液,用緩沖液稀釋抗體至各效價(jià)為終產(chǎn)品中抗體效價(jià)的2-4倍, 備用;所述終產(chǎn)品中所含抗體效價(jià)均為100-50000滴度,優(yōu)選的,效價(jià)為1000-10000滴度; 所述抗體原液為由流感病毒和致病菌混合抗原制備的抗體原液,或者是分別由流感病毒 抗原和致病菌抗原制備兩個(gè)抗體原液的混合液;
[0017] (2)取聚乙二醇,用純凈水將聚乙二醇調(diào)配成5-10倍于終濃度的溶液,優(yōu)選的, 制備成10-50% (w/v)的高濃度溶液,備用;所述聚乙二醇的終濃度為1-10% (w/v);
[0018] (3)取氯已定,用純凈水稀釋至終產(chǎn)品體積的50%或以上的體積,備用;所述氯已 定的含量為0.001 %-1 % (w/v),優(yōu)選的,含量為0.01 %-0.1 % (w/v);
[0019] (4)將步驟(2)制得的聚乙二醇水溶液和步驟(3)制得的氯已定水溶液預(yù)混合后 再加入步驟(1)制得的抗體液,混勻,如果體積不到終產(chǎn)品的體積量,用純凈水定容至終產(chǎn) 品的體積量;優(yōu)選的,定容后加入終濃度〇. 1% (v/v)的香精,混勾;
[0020] (5)制備好的混合液經(jīng)0. 2 μ -0. 45 μ濾膜過(guò)濾后灌裝于口腔噴霧瓶中。優(yōu)選的, 所述抗體原液為雞蛋抗體原液和山羊抗體原液的一種或兩種。
[0021] 優(yōu)選的,所述雞蛋抗體原液的制備方法包括如下步驟:
[0022] (1)用抗原乳化液連續(xù)免疫母雞,每10-14天一次,免疫4-5次后收集雞蛋,每連續(xù) 收集1個(gè)月雞蛋后需補(bǔ)充免疫一次,繼續(xù)收集雞蛋,分離出蛋黃;
[0023] (2)加入蛋黃重量1-10倍的0. 1-10%甘露醇水溶液稀釋蛋黃,離心,收集含抗體 的上清液;
[0024] (3)將該上清液加到經(jīng)上樣緩沖液平衡的DEAE離子樹(shù)脂柱,依次從低到高用 0. I-IM濃度的NaCl緩沖液洗脫柱子,收集0. 5-0. 8Μ的NaCl洗脫的含IgY抗體流分;
[0025] (4)用PBS緩沖液調(diào)節(jié)或濃縮純化抗體效價(jià)至1000滴度以上,分裝后低溫儲(chǔ)存,備 用。
[0026] 優(yōu)選的,所述山羊抗體原液的制備方法包括如下步驟:
[0027] (1)用抗原乳化液連續(xù)免疫山羊3-5次,每10-14天免疫一次,抽血并提取血清;
[0028] (2)加入1-5倍于血清量的30% PEG-6000溶液,靜置1-12小時(shí)后高速離心,棄去 上清,將沉淀用5-50倍體積量的PBS緩沖液溶解;
[0029] (3)將該沉淀溶解液通過(guò)活性炭柱過(guò)濾,收集抗體濾液;優(yōu)選的,進(jìn)一步用 protein-A親和柱純化抗體;
[0030] (4)將步驟(3)制得的抗體液用PBS緩沖液調(diào)節(jié)或濃縮抗體效價(jià)至1000滴度以 上,分裝后低溫儲(chǔ)存,備用。
[0031] 優(yōu)選的,所述抗原乳化液的制備方法包括如下步驟:
[0032] 將經(jīng)裂解滅活的流感病毒和致病菌分別或二者組合與LPS、橄欖油、TweenSO按照 2 :0. 2:1:0. 8的質(zhì)量比例混合,然后用超聲波乳化制得組合抗原乳化液。
[0033] 優(yōu)選的,所述裂解滅活的流感病毒包括:甲型流感病毒H0N1、H1N1、H2N2、H3N2及 禽流感病毒H5N1、H9N2、H7N9中的一種或兩種以上;
[0034] 所述裂解滅活的致病菌包括:溶血性鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎球菌、葡萄球菌 抗體中的一種或兩種以上。
[0035] 本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:本發(fā)明將氯已定和具有抗病毒功效的特異抗 體配伍,通過(guò)改進(jìn)配制程序,將稀釋后的氯已定水溶液先與聚乙二醇水溶液混合后,再與含 抗體的緩沖液混合,避免了氯已定與抗體蛋白或緩沖鹽溶液接觸生成沉淀而降低活性的問(wèn) 題,能夠既抗病毒又抗細(xì)菌;制備得到的復(fù)合抗體口腔噴劑作為預(yù)防感冒的藥物使用,其降 低感染率高達(dá)80%,并且,氯已定和抗體配伍的功效,優(yōu)于單獨(dú)使用氯已定和抗體的效果之 和,具有協(xié)同作用。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明,但不限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0037] 實(shí)施例1
[0038] 抗流感病毒及致病菌抗體原液的制備方法,包括如下步驟:
[0039] (1)將經(jīng)裂解滅活的流感病毒抗原按HlNl :H2N2 :H3N2 = 2 :1 :2的質(zhì)量比例混合 后制得病毒組合抗原;
[0040] (2)將經(jīng)裂解滅活的溶血性鏈球菌和肺炎球菌的菌體按1 :1的質(zhì)量比例混合后制 得致病菌組合抗原;
[0041] (3)將步驟(1)得到的病毒組合抗原和步驟(2)得到的致病菌組合抗原按1 :1的 質(zhì)量比例混合,再將混合后的抗原與LPS、橄欖油及Tween80按2:0. 2 :1:0. 8的質(zhì)量比例混 合,然后用超聲波乳化5min,制得病毒-細(xì)菌組合抗原乳化液;
[0042] (4)用該抗原乳化液連續(xù)免疫母雞5次,每10天免疫一次,收集雞蛋,每連續(xù)收集 1個(gè)月雞蛋后需補(bǔ)充免疫一次,將雞蛋分離出蛋黃,加5倍量的1 %甘露醇水溶液稀釋蛋黃, IOOOOrpm離心,收集含抗體的上清液;
[0043] (5)將該上清液加到PBS平衡過(guò)的DEAE離子樹(shù)脂柱,依次用0. 2M、0. 4M、0. 7M的 NaCl洗脫柱子,收集0. 7M的NaCl洗脫的流分,便得到純度約90%的IgY抗體;
[0044] (6)用PBS緩沖液調(diào)純化抗體效價(jià)至10000滴度,便制得抗流感病毒及致病菌抗體 原液,分裝后-20 °C儲(chǔ)存,備用。
[0045] 實(shí)施例2
[0046] 抗禽流感病毒及致病菌抗體原液的制備方法,包括如下步驟:
[0047] (1)將經(jīng)裂解滅活的禽流感病毒抗原按H5N1 :H9N2 :H7N9 = 2 :1 :2的質(zhì)量比例混 合后制得病毒組合抗原;
[0048] (2)將經(jīng)裂解滅活的肺炎球菌和葡萄球菌菌體按1 :1的質(zhì)量比例混合后制得致病 菌組合抗原;
[0049] (3)將步驟(1)制得的病毒組合抗原和步驟(2)制得的致病菌組合抗原按2 :1的 質(zhì)量比例混合后再與LPS、橄欖油及Tween80按2:0. 2 :1:0. 8的質(zhì)量比例混合,之后用超聲 波乳化5min,制得病毒-細(xì)菌組合抗原乳化液;
[0050] (4)用該抗原乳化液連續(xù)免疫山羊4次,每?jī)芍苊庖咭淮?,提取血清?br>[0051] (5)然后加入2倍于血清量的30%的PEG-6000,靜置2h后 10000rpm離心20min, 棄去上清,將沉淀用20倍體積的PBS溶解;
[0052] (6)將該抗體溶解液通過(guò)活性炭柱過(guò)濾去除病毒及微生物;
[0053] (7)用PBS緩沖液調(diào)節(jié)純化抗體效價(jià)至10000滴度,便制得抗禽流感病毒及致病菌 抗體原液,分裝后