基于中國(guó)人群的原代人源乳腺癌移植瘤模型的建立方法及模型的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)療評(píng)價(jià)、檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及基于中國(guó)人群的原代人源乳腺癌移植瘤模型的建立方法及模型。
【背景技術(shù)】
[0002]在女性生殖系惡性腫瘤中，乳腺癌約占全身惡性腫瘤的7%?10%，發(fā)病率占婦科惡性腫瘤的第一位，全世界每年新發(fā)乳腺癌越150萬例，死亡57萬例。乳腺癌的發(fā)病在世界范圍內(nèi)呈明顯上升趨勢(shì)，無論在高發(fā)區(qū)還是低發(fā)區(qū)，乳腺癌發(fā)病率均以5-20%的不同速度上升。
[0003]乳腺癌動(dòng)物模型被普遍應(yīng)用于抗乳腺癌藥物篩選和藥效學(xué)研宄，已有較多文獻(xiàn)報(bào)道了現(xiàn)有的乳腺癌動(dòng)物模型在抗乳腺癌藥物篩選和藥效學(xué)研宄上的應(yīng)用。乳腺癌動(dòng)物模型的制作對(duì)研宄乳腺癌的病因、發(fā)病機(jī)理，從而對(duì)其進(jìn)行有效預(yù)防、提高治療效果起到非常關(guān)鍵的作用，尤其在抗癌藥物的藥理研宄中更為重要。
[0004]自發(fā)性和誘發(fā)性乳腺癌動(dòng)物模型發(fā)生的條件比較自然，與人類患病過程更為相似，還有利于觀察遺傳因素及環(huán)境因素對(duì)腫瘤發(fā)生的影響，但此模型腫瘤發(fā)生的潛伏期長(zhǎng)，病程與癌塊大小無法，成功率低，故均不適合乳腺癌治療藥物的藥效學(xué)評(píng)價(jià)。
[0005]移植性乳腺癌模型的移植物來源于自發(fā)性或誘發(fā)性乳腺腫瘤細(xì)胞株，或人類乳腺細(xì)胞株。通過瘤細(xì)胞懸液注射、瘤組織小塊接種等方法將腫瘤原位或異位植入動(dòng)物體內(nèi)。瘤株的建立過程，也是腫瘤在動(dòng)物間反復(fù)傳代的過程，大概經(jīng)過20代以后，它的組織類型與生長(zhǎng)特性已趨穩(wěn)定，并能在同系或同種受體動(dòng)物中繼續(xù)傳代，即成為一個(gè)可移植的瘤株。目前人類腫瘤的荷瘤動(dòng)物模型研宄較多的是移植瘤模型，以異種移植模型為主，移植方法包括組織塊移植法，細(xì)胞種植法，腎包膜下移植法等。
[0006]目前用于移植的人乳腺癌細(xì)胞系有二十多種，主要包括MCF-7、BT-474、T47D、HBL-100、MDA-MB-435細(xì)胞等，其中應(yīng)用較多的是MCF-7細(xì)胞。盡管已有許多用Nod-SCID鼠重建人體免疫系統(tǒng)和移植人類腫瘤成功的報(bào)道，但是由于細(xì)胞系傳代過多已經(jīng)積累了很多突變即在很多方面它的生理學(xué)特性已經(jīng)改變，很多在我們真實(shí)的人體內(nèi)的乳腺癌的生物學(xué)特性無法用細(xì)胞系移植瘤模型去研宄，在細(xì)胞系移植瘤模型上得到的研宄結(jié)果也很多無法用于臨床病人的治療實(shí)踐當(dāng)中。相比之下，原代人源乳腺癌移植瘤模型直接來源于病人的術(shù)中的乳腺癌組織，可以基本上真實(shí)的反映乳腺癌的生物學(xué)特性，在原代人源乳腺癌移植瘤模型上取得的研宄成果也能較直接應(yīng)用于日常的乳腺癌病人的治療當(dāng)中。而目前尚未見國(guó)內(nèi)外有關(guān)基于中國(guó)人群的原代人源乳腺癌移植瘤模型的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的之一在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于中國(guó)人群的原代人源乳腺癌移植瘤模型的建立方法。
[0008]本發(fā)明的目的之一在于提供一種基于中國(guó)人群的原代人源乳腺癌移植瘤模型。
[0009]本發(fā)明一方面公開了一種基于中國(guó)人群的原代人源乳腺癌移植瘤模型的建立方法，包括如下步驟:
[0010]I)人乳腺癌組織標(biāo)本的獲取
[0011]取人乳腺癌組織標(biāo)本放入預(yù)冷裝有1640的離心管中并埋入冰中，在20分鐘內(nèi)送入動(dòng)物房；
[0012]2)第一次接種
[0013]將步驟I)獲取的人乳腺癌組織標(biāo)本倒入裝有4°C含雙抗PBS的培養(yǎng)皿中清洗，然后將人乳腺癌組織標(biāo)本剪成塊狀移入套管針內(nèi)備用；第一次接種小鼠在接種前4到5天前依托泊苷腹腔注射抑制免疫，接種時(shí)，將第一次接種小鼠兩側(cè)背部剃毛，剃毛部位酒精消毒處理，然后在第一次接種小鼠上肢近端背側(cè)的進(jìn)針部位剪小口，進(jìn)針?biāo)腿巳橄侔┙M織標(biāo)本進(jìn)行接種，接種完畢后，進(jìn)針部位消毒處理；
[0014]3)培養(yǎng)第一次接種小鼠
[0015]喂養(yǎng)第一次接種小鼠形成瘤體體積在300-500mm3的第一次瘤體小鼠，喂養(yǎng)過程中，喂養(yǎng)含雌激素的飲用水；另外喂養(yǎng)過程中每周換籠兩次，換籠時(shí)，將新的籠蓋、籠盒噴灑75%酒精溶液，然后置于超凈臺(tái)內(nèi)紫外線照射消毒處理；
[0016]4)第二次接種
[0017]采用頸椎脫臼法處死步驟3)培養(yǎng)的成瘤小鼠，瘤體部位消毒后游離下腫瘤組織放入裝有4°C的PBS培養(yǎng)皿中；然后把腫瘤組織剪成大小約2*2mm小塊，留2塊3*3mm大小待做石蠟；將腫瘤小塊裝入套管針備用；第二次接種小鼠在接種前4到5天前依托泊苷腹腔注射抑制免疫，接種時(shí)，將第二次接種小鼠兩側(cè)背部剃毛，剃毛部位酒精消毒處理，然后在第二次接種小鼠上肢近端背側(cè)的進(jìn)針部位剪小口，進(jìn)針?biāo)腿巳橄侔┙M織標(biāo)本進(jìn)行接種，接種完畢后，進(jìn)針部位消毒處理；
[0018]5)培養(yǎng)第二次接種小鼠
[0019]喂養(yǎng)第二次接種小鼠形成瘤體體積在300-500mm3的第二次瘤體小鼠，喂養(yǎng)過程中，喂養(yǎng)含雌激素的飲用水；另外喂養(yǎng)過程中每周換籠兩次，換籠時(shí)，將新的籠蓋、籠盒噴灑75%酒精溶液，然后置于超凈臺(tái)內(nèi)紫外線照射消毒處理；
[0020]6)第三次接種
[0021]采用頸椎脫臼法處死步驟5)培養(yǎng)的第二次成瘤小鼠，瘤體部位消毒后游離下腫瘤組織放入裝有4°C的PBS培養(yǎng)皿中；然后把腫瘤組織剪成大小約2*2mm小塊，留2塊3*3_大小待做石蠟；將腫瘤小塊裝入套管針備用；第二次接種小鼠在接種前4到5天前依托泊苷腹腔注射抑制免疫，接種時(shí)，將第二次接種小鼠兩側(cè)背部剃毛，剃毛部位酒精消毒處理，然后在第二次接種小鼠上肢近端背側(cè)的進(jìn)針部位剪小口，進(jìn)針?biāo)腿巳橄侔┙M織標(biāo)本進(jìn)行接種，接種完畢后，進(jìn)針部位消毒處理；
[0022]7)培養(yǎng)第三次接種小鼠
[0023]喂養(yǎng)第三次接種小鼠形成瘤體體積在300-500mm3的第三次瘤體小鼠建成乳腺癌動(dòng)物模型，喂養(yǎng)過程中，喂養(yǎng)含雌激素的飲用水；另外喂養(yǎng)過程中每周換籠兩次，換籠時(shí)，將新的籠蓋、籠盒噴灑75%酒精溶液，然后置于超凈臺(tái)內(nèi)紫外線照射消毒處理。
[0024]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述雌激素水溶液的配制方法是:先將1.5mg17β雌二醇溶解于10ul 75%的酒精溶液中進(jìn)行殺菌，然后再將所配制的10ul 17 β雌二醇酒精溶液溶入250ml飲用水中即可。這樣做的目的是由于免疫缺陷小鼠很容易遭受細(xì)菌感染而死亡，本發(fā)明先將17β雌二醇溶入75%酒精溶液中就可以殺滅絕大部分的細(xì)菌再溶解在無菌飲用水中喂食免疫缺陷小鼠，從而實(shí)現(xiàn)無菌喂養(yǎng)，不會(huì)對(duì)免疫缺陷小鼠造成污染。再者現(xiàn)有皮下植入雌激素藥片刺激小鼠腫瘤生長(zhǎng)的方法只能維持90天，而本發(fā)明小鼠第一次成瘤基本上都要180天左右，因此注射雌激素?zé)o法達(dá)到穩(wěn)定對(duì)小鼠腫瘤的刺激生長(zhǎng)。
[0025]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述小鼠可以選自裸鼠、SCID鼠或Nod-SCID鼠。
[0026]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述人乳腺癌組織標(biāo)本為空芯針穿刺乳腺癌標(biāo)本、手術(shù)乳腺癌標(biāo)本、轉(zhuǎn)移病人肝穿刺標(biāo)本、轉(zhuǎn)移病人肺穿刺標(biāo)本或轉(zhuǎn)移病人骨穿刺標(biāo)本。
[0027]本發(fā)明第二方面公開了基于中國(guó)人群的原代人源乳腺癌移植瘤模型，采用前述方法建立而獲得。
[0028]該基于中國(guó)人群的原代人源乳腺癌移植瘤模型可作抗乳腺癌藥物篩選和藥效學(xué)研宄中的試驗(yàn)動(dòng)物。
[0029]本發(fā)明直接利用人乳腺癌組織標(biāo)本來建立原代人源乳腺癌移植瘤模型，一定程度上開創(chuàng)了利用中國(guó)人群的原代人源乳腺癌移植瘤模型去研宄真實(shí)人體內(nèi)的乳腺癌的生物學(xué)特性的先河，其在該模型上建立的研宄成果可用于臨床病人的治療并能夠篩選出最適合每個(gè)中國(guó)乳腺癌病人的藥物，克服了國(guó)內(nèi)現(xiàn)有移植瘤模型所存在的因?yàn)閭鞔^多所積累的很多突變所造成的生物學(xué)特性的改變，無法真實(shí)反映人體內(nèi)的乳腺癌的生物學(xué)特性的問題。
[0030]本發(fā)明在國(guó)內(nèi)外率先采用飲水雌激素結(jié)合聯(lián)合免疫缺陷的小鼠的方法進(jìn)行原代人源乳腺癌移植瘤模型的建立，國(guó)外雖已采用聯(lián)合免疫缺陷的小鼠(SCID鼠或Nod-SCID鼠)進(jìn)行相關(guān)模型的建立，但所使用的給予雌激素的方法不能實(shí)現(xiàn)對(duì)移植瘤的長(zhǎng)期穩(wěn)定的刺激，而飲水雌激素恰恰能實(shí)現(xiàn)對(duì)原代人源乳腺癌移植瘤生長(zhǎng)的穩(wěn)定和持久的刺激。
【附圖說明】
[0031]圖1為本發(fā)明的基于中國(guó)人群的原代人源乳腺癌移植瘤模型(第5代，Ρ5)與乳腺癌組織來源病人的免疫組化情況對(duì)比示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0032]1.材料
[0033]1.1 動(dòng)物
[0034]1.1.1.Female SCID 小鼠 4_6ws0
[0035]1.1.2.上海瑞金醫(yī)院動(dòng)物房飼養(yǎng)。
[0036]1.1.3.雌激素為17 β雌二醇。含雌激素的飲用水的配制方法是先將1.5mgl7 0雌二醇溶解于10ul 75%的酒精溶液中進(jìn)行殺菌，然后再將所配制的10ul 17β雌二醇酒精溶液溶入250ml飲用水中即可。
[0037]1.2器械及耗材
[0038]1.2.1刮毛器、打洞器(耳號(hào)鉗)、電子秤、卡尺、培養(yǎng)皿、15ml離心管
[0039]1.2.21640、10%福爾馬林、Allprotect tumor tissue agent、P