一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)載藥微粒系統(tǒng)制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明公開一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)載藥微粒系統(tǒng)制備方法，可用于體內(nèi)遞送藥物至病 灶部位而發(fā)揮藥效，屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白質(zhì)載藥微粒系統(tǒng)用于遞送藥物是目前研究大熱點(diǎn)，通過體內(nèi)相容性好蛋白質(zhì) 遞送藥物至病灶部位，靶向至病灶緩慢釋放，可以延長藥物半衰期和降低藥物毒性，從而可 以提1?療效，降低藥物毒性。
[0003] 蛋白質(zhì)微粒作為研究熱點(diǎn)，有眾多報道蛋白質(zhì)微粒制備方法，包括熱交聯(lián)、化學(xué)交 聯(lián)、乳化法等。這些制備方法中典型代表為乳化高壓均質(zhì)法，2005年上市紫杉醇白蛋白納米 粒（abraxane)是成功的代表，開創(chuàng)蛋白質(zhì)微粒系統(tǒng)臨床治療的先河。Abraxane采用乳化高 壓均質(zhì)法技術(shù)(美國專利US6749868, US5560933)，將白蛋白溶液、紫杉醇的乙醇溶液和三 氯甲烷混合形成乳液，然后使用高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行制粒，接著高溫去除有機(jī)溶劑后再水化，即 可制備出紫杉醇白蛋白納米粒。該制備方法復(fù)雜，使用高壓均質(zhì)和高溫等條件，容易造成蛋 白質(zhì)變性，失去生物活性，也增大了成本，其次使用到三氯甲烷等毒性大溶劑，這無疑影響 到產(chǎn)品安全性。
[0004] CN201010247885. 7公開一種制備用于體內(nèi)遞送藥理活性物質(zhì)的蛋白納米粒的方 法，利用蛋白質(zhì)在55-75°C左右打開蛋白質(zhì)疏水性區(qū)域，而利用蛋白質(zhì)二硫鍵打開再折疊自 組裝方法將藥物包埋蛋白納米粒中。但該方法需要在高溫55-75 °C左右反應(yīng)，致使很多藥理 活性物質(zhì)無法耐受高溫，比如紫杉醇在高溫下其7-表紫杉醇雜質(zhì)會線性增大，從而影響產(chǎn) 品的質(zhì)量。
[0005] 在現(xiàn)行制備方法中，基本都是根據(jù)蛋白質(zhì)變性原理，采用高溫、高壓、化學(xué)變性物 質(zhì)固化蛋白，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)微粒系統(tǒng)的制備。然而無論是高壓、高溫、化學(xué)變性劑都使得產(chǎn)品 質(zhì)量存在未知不安全因素。要么對蛋白質(zhì)活性有損失，要么影響藥物和產(chǎn)品質(zhì)量，均存在一 定缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)載藥微粒系統(tǒng)制備方法，解決上述蛋白質(zhì)微粒制備 時高溫、高壓或化學(xué)變性劑等缺陷，可在低溫、常壓和無化學(xué)變性劑的條件下利用橋梁劑溶 液方法制備成蛋白質(zhì)載藥微粒系統(tǒng)，進(jìn)一步保障蛋白質(zhì)活性和蛋白質(zhì)載藥微粒系統(tǒng)的產(chǎn)品 質(zhì)量。同時應(yīng)用這種制劑系統(tǒng)遞送藥物至體內(nèi)而發(fā)揮藥效。本發(fā)明制備工藝簡單，適合產(chǎn) 業(yè)化。
[0007] 本發(fā)明提供一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)載藥微粒系統(tǒng)制備方法，其利用橋梁劑將含藥物的 有機(jī)相和含蛋白質(zhì)的水相溶液混合成均相溶液；來實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)載藥微粒系統(tǒng)的制備，其具 體步驟如下： 1)用有機(jī)溶劑溶解藥物，形成含藥有機(jī)相； 2) 將蛋白質(zhì)溶于水或緩沖體系中制備成l(T500mg/ml的蛋白質(zhì)的水相溶液； 3) 在步驟1)中加入P/Γ飽和的橋梁劑溶液混勻，然后將2)中蛋白質(zhì)水相溶液加入， 混勻成均相溶液； 4) 在(T80°C條件下，將步驟3)中形成均相溶液直接冷凍干燥制備成凍干粉針，采用5% 葡萄糖或生理鹽水等配伍稀釋，即形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)載藥微粒系統(tǒng)； 或?qū)⒉襟E3)中均相溶液直接使用水或5%葡萄糖、生理鹽水、緩沖鹽體系進(jìn)行稀釋，形 成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)載藥微粒系統(tǒng)； 所述橋梁劑為鹽酸鹽，硫酸鹽，磷酸鹽，碳酸鹽中任意一種。
[0008] 本發(fā)明所述的橋梁劑優(yōu)選氯化鈉，硫酸銨，氯化鉀，硫酸鈉，硫酸鎂，磷酸鈉，磷酸 鉀，磷酸二氫鈉，碳酸鈉。
[0009] 本發(fā)明核心技術(shù)為通過橋梁劑將含藥物有機(jī)相與蛋白質(zhì)水相溶液混勻成均相溶 液來制備蛋白質(zhì)載藥微粒系統(tǒng)，其所述的橋梁劑為鹽酸鹽，硫酸鹽，磷酸鹽，碳酸鹽。優(yōu)選氯 化鈉，硫酸銨，氯化鉀，硫酸鈉，硫酸鎂，磷酸鈉，磷酸鉀，磷酸二氫鈉，碳酸鈉。更優(yōu)選氯化 鈉。
[0010] 本發(fā)明的制備方法中步驟1)所述有機(jī)溶劑為醇類，酮類，酰胺類或亞砜類，優(yōu)選乙 醇、叔丁醇、丙酮、N，N-二甲基乙酰胺、二甲亞砜。
[0011] 本技術(shù)方案制備方法中步驟2)所述蛋白質(zhì)為白蛋白，血紅蛋白，肌紅蛋白，溶菌 酶，免疫球蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白，球蛋白，股原蛋白。優(yōu)選為人血白蛋白。
[0012] 本技術(shù)方案所述在于步驟4)所述稀釋的倍數(shù)為1~500倍，優(yōu)選為10-50倍。
[0013] 本發(fā)明提供一種穩(wěn)定蛋白質(zhì)載藥微粒系統(tǒng)制備方法，其特征在于：所述包載藥物 為抗腫瘤藥物，優(yōu)選紫杉醇，多烯紫杉醇，卡巴他賽，阿霉素，替西羅莫司，西羅莫司，絲裂霉 素，羅米地辛，SN38,順鉬及其衍生物，伊立替康、拓?fù)涮婵?、埃博霉素，伊沙匹龍，硼替佐米?更優(yōu)選為紫杉醇。
[0014] 本發(fā)明所述蛋白質(zhì)穩(wěn)定微粒系統(tǒng)的平均粒徑為IOnnTlO μ m，優(yōu)選為50nnT500nm, 最優(yōu)選為50nm?250nm。
[0015] 本發(fā)明進(jìn)一步公開一種穩(wěn)定的人血白蛋白載地西他濱微粒系統(tǒng)制備方法，包括以 下步驟：首先用二甲亞砜溶解地西他濱，然后在有機(jī)相中加入1~15%氯化鈉溶液，混合均勻 后，加入l(T500mg/ml pH 7~8人血白蛋白緩沖液，混勻?yàn)榫嗳芤汉?，分裝，凍干，臨床使 用時采用5%葡萄糖或生理鹽水等稀釋劑配伍稀釋成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)載地西他濱微粒系統(tǒng)。
[0016] 本發(fā)明還公開了一種穩(wěn)定的人血白蛋白載紫杉醇微粒系統(tǒng)制備方法，包括以下步 驟：首先用無水乙醇溶解紫杉醇，然后在有機(jī)相中加入1%~飽和氯化鈉溶液，混合均勻后， 加入l(T500mg/ml白蛋白水溶液，混勻?yàn)榫嗳芤汉?，稀釋到Κ?0倍的(T70°C注射用水 中，人血白蛋白快速包埋紫杉醇形成人血白蛋白載紫杉醇微粒系統(tǒng)。
[0017] 本發(fā)明的穩(wěn)定蛋白質(zhì)載藥微粒系統(tǒng)在臨床使用時可采用生理鹽水、葡糖糖溶液等 配伍稀釋后直接注射或靜脈滴注給藥。
[0018] 本發(fā)明的積極效果在于：制備方法工藝簡單，條件溫和，適合產(chǎn)業(yè)化，克服現(xiàn)有制 備方法中使用高溫、高壓或化學(xué)交聯(lián)劑等缺點(diǎn)，可在溫和條件下，利用橋梁劑溶液將含藥物 的有機(jī)相和含蛋白質(zhì)的水相溶液混合成均相溶液；來制備穩(wěn)定蛋白質(zhì)載藥微粒系統(tǒng)。
[0019] 本發(fā)明制備穩(wěn)定蛋白質(zhì)載藥微粒系統(tǒng)還可以使用超濾洗滌濃縮裝置，致使微粒系 統(tǒng)更適宜產(chǎn)業(yè)化，同時通過除水步驟制備成藥物制劑，進(jìn)一步增大蛋白質(zhì)穩(wěn)定微粒系統(tǒng)的 穩(wěn)定性和實(shí)用性，方便使用，存儲和運(yùn)輸。
【附圖說明】
[0020] 圖1、人血白蛋白載絲裂霉素微粒系統(tǒng)的粒徑分布結(jié)果。
[0021] 圖2、人血白蛋白載紫杉醇微粒系統(tǒng)的粒徑分布結(jié)果。
[0022] 圖3、人血白蛋白載紫杉醇微粒復(fù)溶后溶液照片。
[0023] 圖4、橋梁劑在含藥有機(jī)相和人血白蛋白水相中作用驗(yàn)證。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 以下通過實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，必須說明，本發(fā)明的實(shí)施例是用于說明本 發(fā)明，而不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。
[0025] 實(shí)施例1 將IOmg絲裂霉素溶于Iml N，N-二甲基乙酰胺中，然后加入5%氯化鈉溶液Iml混合 均勻，最后加入用pH 7. 8磷酸鹽緩沖液溶解成20%人血清白蛋白溶液2ml，形成均相溶液。 在〇°C下，將該均相溶液直接凍干成粉針制劑，最后粉針成品采用生理鹽水稀釋，采用馬爾 文粒度分析儀ZS90測定粒徑和HPLC測定載藥量。結(jié)果顯示人血白蛋白載絲裂霉素微粒系 統(tǒng)平均粒徑為290. 9nm，粒徑及其粒徑分布圖見圖1。微粒載藥量達(dá)2. 1%。
[0026] 實(shí)施例2 將Img硼替佐米溶于Iml叔丁醇中，然后加入2%氯化鈉溶液0. 5ml混合均勻，最后加 入2%牛血清白蛋白溶液0. 5ml，形成均相溶液。在室溫下，將該均相溶液直接凍干成粉針制 齊U，最后粉針成品采用生理鹽水稀釋，采用馬爾文粒度分析儀ZS90測定粒徑和HPLC測定微 粒載藥量，結(jié)果表明制備微粒系統(tǒng)平均粒徑為164nm，微粒載藥量達(dá)7. 8%。
[0027] 實(shí)施例3 將IOmg地西他濱溶于Iml二甲亞砜中，然后加入1%磷酸鈉溶液Iml混合均勻，最后 加入用pH 7.0磷酸鹽緩沖液溶解成50%牛血清白蛋白溶液0.4ml，形成均相溶液。在室溫 下，將該均相溶液直接凍干成粉針制劑，最后粉針成品采用生理鹽水稀釋，采用馬爾文粒度 分析儀ZS90測定粒徑和HPLC測定微粒載藥量，結(jié)果表明制備微粒系統(tǒng)平均粒徑為264nm， 微粒載藥量達(dá)4. 1%。
[0028] 實(shí)施例4 將40mg紫杉醇溶于4ml乙醇中，然后加入12. 5%氯化鈉溶液2ml混合均勻，最后加入 10%人血白蛋白溶液I. 0ml，形成均相溶液。將該均相溶液在40°C下使用注射用水稀釋100 倍，得到淡藍(lán)色澄清溶液。采用馬爾文粒度分析儀ZS90測定粒徑和HPLC測定微粒載藥量， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明制備微粒系統(tǒng)平均粒徑為102nm，粒分布徑圖譜見圖2,微粒載藥量達(dá)18. 4%。 同時將該溶液超濾濃縮后，分裝，凍干，凍干后復(fù)溶溶液稀釋不同濃度圖片見圖3 :a.為人 血白蛋白載紫杉醇微粒復(fù)溶后濃度〇. 2mg/ml溶液照片；b.為人血白蛋白載紫杉醇微粒復(fù) 溶后濃度〇. 5mg/ml溶液照片；c.為人血白蛋白載紫杉醇微粒復(fù)溶后濃度2mg/ml溶液照 片。
[0029] 實(shí)施例5 將6mg紫杉醇溶于2ml甲醇中，然后加入10%氯化鉀溶