RNAi-質(zhì)粒/RNAi-病毒/膠束/脂質(zhì)體、RNAi-質(zhì)粒/ RNAi-病毒/納米/脂質(zhì)體。RNAi-質(zhì)粒和RNAi-噬菌體兩種組合裝載于脂質(zhì)體、膠束、納米 粒在內(nèi)的一種載體或多種載體中時，具體就包括以下制劑：RNAi-質(zhì)粒/ RNAi-噬菌體/脂 質(zhì)體、RNAi-質(zhì)粒/ RNAi-噬菌體/膠束、RNAi-質(zhì)粒/ RNAi-噬菌體/納米粒，或RNAi-質(zhì) 粒/RNAi-噬菌體/膠束/脂質(zhì)體、RNAi-質(zhì)粒/RNAi-噬菌體/納米/脂質(zhì)體。RNAi-病 毒和RNAi-噬菌體兩種組合裝載于脂質(zhì)體、膠束、納米粒在內(nèi)的一種載體或多種載體中時， 具體就包括以下制劑=RNAi-病毒/ RNAi-噬菌體/脂質(zhì)體、RNAi-病毒/ RNAi-噬菌體/ 膠束、RNAi-病毒/ RNAi-噬菌體/納米粒，或RNAi-病毒/RNAi-噬菌體/膠束/脂質(zhì)體、 RNAi-病毒/RNAi-噬菌體/納米/脂質(zhì)體。
[0019] 葉酸受體靶向的干擾Claudin3基因表達的藥物組合物，其葉酸受體靶向成分與 干擾Claudin3基因表達的RNA序列的組裝方式除葉酸受體靶向成分直接與RNAi偶聯(lián)外， 還包含葉酸受體靶向成分修飾在RNAi載體表面的方式。
[0020] 葉酸受體靶向成分直接修飾在質(zhì)粒表面。具體地，質(zhì)粒表面的氨基可與葉酸受體 靶向成分包括葉酸受體的抗體、葉酸及其衍生物、甲氨蝶呤及其衍生物的羧基直接偶聯(lián)，形 成酰胺化復合物?；蛘?，質(zhì)粒還可通過一定的間隔基與葉酸受體靶向成分連接，間隔基包括 聚乙二醇鏈(分子量200?5000Da的聚乙二醇均可)、氨基己酸等。質(zhì)粒與葉酸受體靶向成 分直接偶聯(lián)形成組合物的方法，可包括多種其他任何能讓二者相連的方法，并不限于以上 所列方法。
[0021] 葉酸受體靶向成分直接修飾在病毒、噬菌體、細菌、真菌表面。具體地，病毒、噬菌 體、細菌、真菌表面蛋白的氨基可與葉酸受體靶向成分包括葉酸受體的抗體、葉酸及其衍 生物、甲氨蝶呤及其衍生物的羧基直接偶聯(lián)，形成酰胺化復合物?；蛘?，病毒、噬菌體、細 菌、真菌還可通過一定的間隔基與葉酸受體靶向成分連接，間隔基包括聚乙二醇鏈(分子量 200?5000Da的聚乙二醇均可)、氨基己酸等。病毒、噬菌體、細菌、真菌與葉酸受體靶向成 分直接偶聯(lián)形成組合物的方法，可包括多種其他任何能讓二者相連的方法，并不限于以上 所列方法。
[0022] 葉酸受體靶向成分直接修飾在脂質(zhì)體、膠束、納米粒表面。具體地，脂質(zhì)體、膠束、 納米粒表面的氨基可與葉酸受體靶向成分包括葉酸受體的抗體、葉酸及其衍生物、甲氨蝶 呤及其衍生物的羧基直接偶聯(lián)，形成酰胺化復合物?；蛘?，脂質(zhì)體、膠束、納米粒還可通過一 定的間隔基與葉酸受體靶向成分連接，間隔基包括聚乙二醇鏈(分子量200?5000Da的聚 乙二醇均可)、氨基己酸等。脂質(zhì)體、膠束、納米粒與葉酸受體靶向成分直接偶聯(lián)形成組合物 的方法，可包括多種其他任何能讓二者相連的方法，并不限于以上所列方法。
[0023] 本發(fā)明提供的葉酸受體靶向的干擾Claudin3基因表達的藥物組合物，可以特 異性與腫瘤細胞表面高表達的葉酸受體結(jié)合，并通過葉酸受體介導的高效內(nèi)吞作用提高 Claudin3的干擾效率，從而提高抗腫瘤效果。
[0024] 葉酸受體靶向的干擾Claudin3基因表達的脂質(zhì)體包含磷脂和膽固醇兩類脂質(zhì)材 料，也可添加其他任何藥學上可接受的成分。磷脂種類很多，可采用制劑領域常用于制備脂 質(zhì)體的磷脂類型；膽固醇也可采用制劑領域常用于制備脂質(zhì)體的膽固醇類型。具體地，制備 葉酸受體靶向的干擾Claudin3基因表達的脂質(zhì)體時，采用的脂質(zhì)為中性脂質(zhì)，負電荷脂質(zhì) 或正電荷脂質(zhì)材料，包括：憐脂、大?憐脂、卵憐脂、腦憐脂、銷憐脂、-甲基雙十八燒基漠化 銨（DDAB)、sn-甘油1，2 -二油酰-3 -磷酸膽堿（DOPC)、1，2 -二油酰基-3 -三甲基 銨丙烷(氯化物鹽）（D0TAP)、1，2 -二十八烷基-SN-甘油-3-磷酸乙醇胺（DSPE)、膽固 醇、[N- (Ν'，Ν'-二甲基氨基乙烷）-氨基甲?；鵠膽留醇鹽酸鹽（DC-膽固醇)。
[0025] 其中，磷脂(包括磷脂衍生物)與膽固醇（包括膽固醇衍生物)摩爾比為0.5 : 1? 10 : 1，PEG修飾脂質(zhì)占總脂質(zhì)摩爾數(shù)的0.01?15%，葉酸占總脂質(zhì)摩爾數(shù)的0.01?2. 5%， PEG分子量為200?5000。
【附圖說明】
[0026] 圖1葉酸受體靶向的干擾Claudin3基因表達的藥物組合物抗人卵巢癌試驗結(jié) 果（實施例25)。與對照組比較，葉酸受體靶向的干擾Claudin3基因表達的藥物組合物 抑瘤率達90%，顯著優(yōu)于非葉酸受體靶向的干擾Claudin3基因表達的藥物組合物（72%) (p〈0. 001);Western Blot和免疫組化分析結(jié)果顯示，葉酸受體祀向的干擾Claudin3基因 表達的藥物組合物幾乎完全抑制Claudin3在腫瘤細胞的表達。
[0027]
【具體實施方式】
[0028] 以下通過對本發(fā)明【具體實施方式】的描述說明但不限制本發(fā)明。
[0029] 實施例1干擾Claudin3基因表達的RNA序列設計 利用 Invitrogen 公司 BLOCK-iT? RNAi Designer 在線設計軟件（lrttp ://rnaidesigner· invitrogen. com/rnaiexpress/)設計干擾 Claudin3 基因表達的 RNA 序列，再與 GeneBank 序 列比較，篩選出不與人體其他任何mRNA存在同源性的序列SEQ1，正義鏈為：GCMCAUCAU CACGUCGCAT T，反義鏈為：UGCGACGUGA UGAUGUUGCT T。
[0030] 實施例2干擾Claudin3基因表達的RNA序列設計 利用在線設計軟件（http://sidirect2. rnai. jp/)，設計干擾Claudin3基因表達的 RNA序列，再與GeneBank序列比較，篩選出不與人體其他任何mRNA存在同源性的序列 SEQ2,正義鏈為：TCCCGCAACA TCATCACGTC GCATTCMGA CGTGCGACGT GATGATGTTG CTTTTTTG， 反義鏈為：AGCTCAAAAA AGCAACATCA TCACGTCGCA CGTCTTGAAT GCGACGTGAT GATGTTGC。
[0031] 實施例3 RNAi表達質(zhì)粒載體構(gòu)建 首先設計并合成編碼對應靶序列的shRNA的DNA模板上下游引物；分別以30 μ L退 火緩沖液，溶解引物上下游片段（I 0D)。各取2 yL上述溶液+16 yL退火緩沖液混勻，力口 熱至94°C后自然退火冷卻至室溫。取I yL退火產(chǎn)物+99 yL水做100倍稀釋。將shRNA 質(zhì)粒表達載體pGenesil-2. 1或pGenesil2. 4以Eco31I限制性內(nèi)切酶進行酶切，酶切產(chǎn)物 以1%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收質(zhì)粒大片段。CLDN3退火片段與pGenisil-2. 1線性化連接。 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5 α大腸桿菌，涂布于含卡那霉素抗性(終濃度為50 μ g/mL)的LB 瓊脂糖培養(yǎng)基平板上，37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。進行小規(guī)模質(zhì)粒抽提，并以SacI做酶切 鑒定。挑取酶切電泳初步驗證的克隆正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌液測序。經(jīng)測序結(jié)果分析：均為插 入正確的克隆質(zhì)粒，而且質(zhì)量均符合設計標準。將成功構(gòu)建的RNAi表達質(zhì)粒載體經(jīng)Qiagen 公司大抽試劑盒（Plasmid extraction and purification EndoFree Plasmid Giga Kits) 大規(guī)模制備，即得，記為 pGenesil2. IshRNA 或 pGenesil2. 4shRNA。
[0032] 實施例4包裝有Claudin3 RNAi的質(zhì)粒直接與葉酸受體祀向成分偶聯(lián)形成組合 物 將0. 05微摩爾NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)和0. 1微摩爾EDC (1-乙基-3 - (3-二甲基 氨基丙基）-碳化二亞胺)加入Iml葉酸單克隆抗體Farletuzumab溶液（5mg/ml )，室溫攪拌 15分鐘；再加入Iml pGenesil2.1shRNA溶液（5mg/ml)中4 °C孵育過夜，再置于透析袋中， 用 IOmM 憐酸鹽緩沖液（pH 7. 4)在 4 ° C 透析 12h，即得 Farletuzumab_pGenesil2· IshRNA 復合物。
[0033] 實施例5?10以α -羧基-ω-氨基聚乙二醇為間隔基制備葉酸修飾脂質(zhì) 具體投料如下：
【主權(quán)項】
1. 一種葉酸受體靶向的干擾Claudin3基因表達的藥物組合物，其特征在于：含有葉 酸受體靶向成分和干擾Claudin3基因表達的RNA序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于所述的葉酸受體靶向成分包括：葉 酸受體的抗體、葉酸、葉酸衍生物、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤衍生物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其特征在于所述的葉酸衍生物包括四氫葉酸、 5-甲基四氫葉酸、5, 10-亞甲基四氫葉酸、5-甲酰四氫葉酸、10-甲酰四氫葉酸、5, 10-二脫 氮四氫葉酸。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1?3所述的藥物組合物，其特征在于干擾Claudin3基因表達的RNA 序列可以不用載體，也可選擇性構(gòu)建在包括質(zhì)粒、病毒、噬菌體、細菌、真菌、脂質(zhì)體、膠束、 納米粒在內(nèi)的一種載體或幾種載體中。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其特征在于病毒包括腺病毒、腺相關病毒、慢病 毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、溶瘤病毒、牛痘病毒、改良安卡拉牛痘病毒、仙臺病毒、單純性皰疹病毒、麻 疫病毒、新城雞癌病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、痘病毒、RNA病毒。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其特征在于細菌包括大腸桿菌、長雙歧桿菌、 乳酸乳球菌、單核細胞增多性李斯特氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、痢疾桿菌、變異鏈球菌、霍亂弧 菌。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1?6所述的藥物組合物，其特征在于葉酸受體靶向成分可以直接與 RNA序列偶聯(lián)，也可修飾在RNA載體的表面。
8. 權(quán)利要求1~7任一項所述的藥物組合物在制備治療腫瘤的藥物中的用途。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物制藥領域。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種葉酸受體靶向的干擾Claudin3基因表達的藥物組合物及其制備方法和用途。本發(fā)明利用可靶向腫瘤細胞表面高表達的葉酸受體成分，將干擾Claudin3基因表達的RNA序列選擇性投遞到腫瘤部位，可提高Claudin3的干擾效率，且抑制癌細胞增長效果明顯，為臨床治療癌癥提供了一種新的選擇。
【IPC分類】A61K48-00, A61K31-713, A61K47-48, A61K31-7088, A61P35-00
【公開號】CN104548129
【申請?zhí)枴緾N201310394072
【發(fā)明人】魏于全, 何治堯, 魏霞蔚, 宋相容
【申請人】四川大學
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2013年9月3日