血清組b腦膜炎球菌和d/t/p的聯(lián)合疫苗的制作方法
【專利說明】血清組B腦膜炎球菌和DA/P的聯(lián)合疫苗
[0001] 本申請要求2012年9月6日提交的美國臨時申請61/697,756的權(quán)益，其全部內(nèi) 容通過引用納入本文以用于所有目的。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明屬于聯(lián)合疫苗，即含有來自多于一種病原體的混合免疫原的疫苗的領(lǐng)域， 從而給予該疫苗可使對象同時獲得針對多于一種病原體的免疫力。
【背景技術(shù)】
[0003] 單一劑量中含有來自多于一種病原性生物體的抗原的疫苗被稱為"多價"疫苗或 "聯(lián)合"疫苗。已有多種聯(lián)合疫苗被許可用于人類，包括用于保護抵抗白喉、破傷風和百日咳 的三價疫苗或保護抵抗麻疫、腿腺炎和風疫的三價疫苗。這些疫苗為患者提供的益處在于 減少了注射次數(shù)，這可導致順應性提高的臨床益處（例如參見參考文獻1的第29章），對小 兒患者尤其如此。
[0004] 提供新型聯(lián)合疫苗的一個難處是，混合組分之間存在疫苗-疫苗負面相互作用的 可能，這可歸因于物理因素或化學因素。例如，參考文獻2討論了抗原聯(lián)用時免疫原性的可 能變化，而參考文獻3報告了聯(lián)合疫苗的開發(fā)涉及的問題遠多于現(xiàn)有抗原的簡單混合。類 似地,參考文獻4綜述了多種臨床相關(guān)相互作用（也參見參考文獻5),而參考文獻6綜述了 制造聯(lián)合疫苗時所面臨的技術(shù)挑戰(zhàn)。
[0005] 本發(fā)明的目的在于，提供新型且改進的聯(lián)合疫苗，而具體是能夠保護抵抗血清組B 腦膜炎球菌和其它病原體的那些。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明人已顯示，血清組B腦膜炎球菌抗原能夠成功地與白喉、破傷風和百日咳類 毒素（"DTP")聯(lián)合，以提供用于保護抵抗多種病原體的有效聯(lián)合疫苗。這些聯(lián)合疫苗在佐 以一定范圍的不同佐劑時均有效，并且在采用小兒型和加強型DTP比例時均有效。所述佐 劑能夠改善所述組合物引發(fā)的免疫應答；或者，通過包括佐劑，所述組合物能夠具有相對較 低量的抗原但仍具有與未加佐劑的聯(lián)合疫苗相當?shù)拿庖咴浴?br>[0007] 因此，一般而言，本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，其包含（a)血清組B腦膜炎球 菌免疫原，和（b)白喉類毒素、破傷風類毒素和/或百日咳類毒素中的至少一種。所述組合 物通常還包含佐劑，例如錯鹽或水包油乳劑。優(yōu)選組分（b)包含白喉類毒素、破傷風類毒素 和百日咳類毒素的全部三種。在一些實施方式中，組分（b)包含的白喉類毒素多于破傷風 類毒素（以Lf單位測量），但在其它實施方式中，其包含的破傷風類毒素多于白喉類毒素。
[0008] 第一方面中，本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含：(a)血 清組B腦膜炎球菌免疫原；(b)白喉類毒素、破傷風類毒素和百日咳類毒素；和（c)佐劑。所 述佐劑可包含一種或多種鋁鹽佐劑、TLR激動劑或水包油乳劑。
[0009] 第二方面中，本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含：(a)血 清組B腦膜炎球菌免疫原；和（b)白喉類毒素、破傷風類毒素和百日咳類毒素，其中存在的 白喉類毒素相對過量于破傷風類毒素（以Lf單位計）。該組合物還可包含佐劑，并且其可 包含一種或多種鋁鹽佐劑、TLR激動劑或水包油乳劑。
[0010] 第三方面中，本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含：(a)血 清組B腦膜炎球菌免疫原；和（b)白喉類毒素、破傷風類毒素和百日咳類毒素，其中存在的 破傷風類毒素相對過量于白喉類毒素（以Lf單位計）。該組合物還可包含佐劑，并且其可 包含一種或多種鋁鹽佐劑、TLR激動劑或水包油乳劑。
[0011] 本發(fā)明的組合物可包含除白喉類毒素、破傷風類毒素和百日咳類毒素以外的抗 原，例如，其可包含Hib莢膜糖（理想上是偶聯(lián)的）、HBsAg、IPV、腦膜炎球菌莢膜糖（理想 上是偶聯(lián)的）等。
[0012] 腦膜炎球菌血清組B免疫原
[0013] 本發(fā)明的免疫原性組合物包含血清組B腦膜炎球菌免疫原。當給予人（或給予合 適的動物模型）時，所述免疫原可引發(fā)殺菌性免疫應答。這些免疫原可以是蛋白質(zhì)、脂糖或 囊泡。
[0014] 本領(lǐng)域已知的不同血清組B腦膜炎球菌蛋白質(zhì)免疫原包括但不限于：NHBA、fHbp 和NadA，如BEXSER0?產(chǎn)品中所見[7, 8]?？砂诒景l(fā)明組合物中的其它蛋白質(zhì)免疫原 有：HmbR、NspA、NhhA、App、0mp85、TbpA、TbpB、Cu, Zn-過氧化歧化酶和 ZnuD。這些免疫原 的其它細節(jié)描述于下文。
[0015] 疫苗可包含這些不同免疫原中的一種或多種，例如，其可包含各NHBA、fHbp和 NadA。其還可包含單一免疫原的多個變體形式，例如，其可包含腦膜炎球菌fHbp的多于一 種變體（即，序列不同的兩種fHbp蛋白[191,9])。
[0016] 所述血清組B腦膜炎球菌蛋白質(zhì)免疫原可以融合蛋白的形式存在。例如，所述 BEXSER0?產(chǎn)品包含兩種融合蛋白：SEQ ID N0:4是NMB2091和fHbp的融合形式；而SEQ ID N0:5是NHBA和NMB1030的融合形式。一種有用的融合蛋白是SEQ ID勵：19，其包含匪82091 和兩拷貝fHbp。
[0017] 血清組B免疫原的兩種有用的組合包括：NHBA，例如SEQ ID NO: 5 ;fHbp例如SEQ IDN0:4或SEQIDN0:19;和NadA，例如SEQIDN0 :6。其它有用的組合包括如下蛋白質(zhì)： 其與SEQ ID NO: 5、4、19和6各有至多5個氨基酸的差異，但保留引發(fā)識別SEQ ID NO: 5、4、 19和6的抗體的能力。
[0018] 優(yōu)選包含至少一種fHbp免疫原的組合物，例如，包含兩種不同fHbp序列的那些。 合適的fHbp組合物在下文詳細討論。
[0019] 因此，本發(fā)明的組合物可有利地包含（a)在參考文獻8中公開為'5CVMB'的三種 血清組B腦膜炎球菌蛋白質(zhì)免疫原的混合物，或（b)在參考文獻10中公開為'rLP2086'的 血清組B腦膜炎球菌蛋白質(zhì)免疫原的混合物。
[0020] 所述血清組B腦膜炎球菌免疫原通常是純化的可溶性重組蛋白。然而，在一些實 施方式中，其可存在于腦膜炎球菌囊泡中。因此，所述組合物可包含腦膜炎球菌囊泡，即，通 過腦膜炎球菌外膜的破壞或出泡以由此形成的保留有源自所述外膜的抗原的囊泡而獲得 的任何蛋白脂質(zhì)體囊泡。因此該術(shù)語包括，例如OMV(有時稱為"小泡")、微囊泡（MV)和"原 初OMV"（ "N0MV)。"本領(lǐng)域已知多種此類囊泡（例如，參見參考文獻11-25)，并且其中任何 囊泡均可包含在本發(fā)明的組合物中。關(guān)于這些囊泡，在下文中有更詳細的說明。然而，在一 些實施方式中，所述組合物不含囊泡。
[0021] 本發(fā)明的組合物可優(yōu)選地在給予后引發(fā)血清殺菌性試驗。這些應答可以在小鼠中 方便地測得，并且是疫苗效力的標準指標。血清殺菌活性（SBA)衡量由補體介導的細菌殺 傷力，并且可以采用人或幼兔補體進行試驗。例如，組合物可在超過90%的受者中誘導至少 4倍的SBA上升。
[0022] 優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物可在人類中引發(fā)保護性抵抗血清組B腦膜炎球菌的免疫 應答。例如，所述疫苗可引發(fā)至少保護性抵抗原型血清組B菌株（例如，MC58)的免疫應答， MC58可通過廣泛途徑獲得（例如，ATCC BAA-335)并且是參考文獻26中測序的菌株。還可 采用其它菌株，但抵抗MC58的應答容易測試。
[0023] 白喉類毒素
[0024] 白喉是由白喉棒狀桿菌（Corynebacterium diphtheriae)，一種或多革蘭氏陽性 無孢子需氧菌產(chǎn)生的。該生物體表達原噬菌體編碼的ADP-核糖基化外毒素（"白喉毒素")， (例如用甲醛）處理后得到無毒但保留抗原性的類毒素，能夠在注射后刺激特異性抗毒素 抗體的產(chǎn)生。參考文獻1的第13章更詳細地揭示了白喉類毒素。優(yōu)選的白喉類毒素是通過 甲醒處理制備的那些。采用可補充牛提取物的生長培養(yǎng)基（如Fenton培養(yǎng)基，或Linggoud 和Fenton培養(yǎng)基）培養(yǎng)白喉棒桿菌（C. diphtheriae),接著進行甲醒處理、超濾和沉淀，可 獲得白喉類毒素。該類毒素物質(zhì)隨后可通過包括無菌過濾和/或透析的方法來處理。
[0025] 組合物可包含足夠的白喉類毒素以引發(fā)至少0. 01IU/ml的循環(huán)白喉抗毒素水平。 白喉類毒素的量一般以"Lf"單位（"絮凝單位〃或〃邊界絮凝劑量〃或〃絮凝限值"）度 量，其定義為：當與一個國際單位的抗毒素混合時，產(chǎn)生最優(yōu)絮凝混合物的毒素/類毒素的 量[27, 28]。例如，NIBSC 提供了'普通白喉類毒素 （Diphtheria Toxoid, Plain)' [29]，其 含有300Lf/安瓿，也提供了'用于絮凝試驗的白喉類毒素的第一國際參比試劑' [30]，其含 有900Lf/安瓿。組合物中白喉類毒素的濃度可以采用絮凝試驗，通過按所述參比試劑校準 的參比物質(zhì)相比較來容易地確定。
[0026] 組合物中的白喉類毒素的免疫效力一般以國際單位（IU)表示。所述效力可通過 將組合物在實驗室動物（通常是豚鼠）中提供的保護與已經(jīng)校準到IU的參比疫苗做比較 來評估。NIBSC提供'白喉類毒素吸附第三國際標準1999(Diphtheria Toxoid Adsorbed Third International Standard 1999)，[31，32]，其包含 160IU/安瓶，并且適用于校準此 類試驗。
[0027] IU與Lf系統(tǒng)間的轉(zhuǎn)換取決于具體的類毒素制劑。
[0028] 本發(fā)明的組合物通常包含1?40Lf白喉類毒素/單位劑量。在白喉類毒素相對過 量于破傷風類毒素（以Lf單位計）存在的小兒型組合物中，所述組合物將一般包含10? 35Lf的白喉類毒素/單位劑量，例如，15?30Lf，例如15、25或30Lf。在破傷風類毒素相 對過量于白喉類毒素過量（以Lf單位計）存在的加強型組合物中，所述組合物將一般包含 1?4Lf的白喉類毒素/單位劑量，例如，1. 5?3Lf，例如2或2. 5Lf。若組合物包含偶聯(lián) 至白喉類毒素的糖抗原，則前述量排除那些偶聯(lián)物中的載體蛋白的量。
[0029] 按IU衡量，小兒型組合物將一般包含>25IU的白喉類毒素/單位劑量，而加強型 組合物將一般包含1?3IU/單位劑量。
[0030] 如果組合物包含鋁鹽佐劑，則所述組合物中的白喉類毒素優(yōu)選被吸附至（更優(yōu)選 被完全吸附至）所述佐劑，并且優(yōu)選被吸附在氫氧化鋁佐劑上。
[0031] 破傷風類毒素
[0032] 破傷風是由破傷風梭菌（Clostridium tetani)，一種革蘭氏陽性有芽孢桿菌產(chǎn)生 的。該生物體表達內(nèi)肽酶（"破傷風毒素"），經(jīng)處理后得到無毒但保留抗原性的類毒素，能 夠在注射后刺激特異性抗毒素抗體的產(chǎn)生。參考文獻1的第27章更詳細地揭示了破傷風 類毒素。優(yōu)選的破傷風類毒素是通過甲醛處理制得的那些。采用生長培養(yǎng)基（如衍生自牛 酪蛋白的Latham培養(yǎng)基）培養(yǎng)破傷風梭菌（C. tetani)，然后進行甲醒處理、超濾和沉淀，能 夠獲得破傷風類毒素。此物質(zhì)隨后可通過包括無菌過濾和/或透析的方法處理。
[0033] 組合物可包含足夠的破傷風類毒素以引發(fā)至少0,01lU/ml的循環(huán)破傷風抗毒素 水平。破傷風類毒素的量一般以〃Lf〃單位（參見上文）表示，其定義為當與一個國際單位 的抗毒