0053] 2)測(cè)定方法；Folin-Ciocalteu 法測(cè)定
[0054] A.標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：分別取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)沒食子酸溶液（0-100y g/mU〇. 5ml 加入1.0ml Folin C試劑，5min后加入2ml Na2C〇3溶液，在50°C水浴下保持5min，冷卻，然 后用分光光度計(jì)測(cè)定溶液在765nm處的吸光值A(chǔ)765,然后根據(jù)所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線得到蘋果多 酷含量Cg?。其標(biāo)準(zhǔn)曲線為：
[005引 C多酪=X Aws-y，R2= Z (此處Z系數(shù)需要大于0.999)
[005引 B.樣液含量測(cè)定；將蘋果多酷提取物的溶液經(jīng)適當(dāng)?shù)南♂尯?，?. 5ml加入1. 0ml 的化lin C試劑，5min后加入2ml NasCOs溶液，在5(TC水浴下保持5min，冷卻，然后用分光 光度計(jì)測(cè)定溶液在765nm處的吸光值A(chǔ)765,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到蘋果多酷含量Cggi。
[0057] 如主要試劑的配制；沒食子酸、Folin-Ciocalteu試劑、10%化2〇)洛液。
[0058] 4)蘋果多酷提取率的計(jì)算方式：
[0059] 蘋果多酷提取率（％ ) = ( W沒食子酸計(jì)ug/g) = (CiXVi) XlOOOAVsXW)
[0060] Cl-樣液中蘋果多酷的含量（ug);
[00川 VI-樣液的體積（mU ;
[0062] V2-測(cè)定取樣液的體積（ul);
[006引 W-果渣樣品量。
[0064] 結(jié)果表明：按照本發(fā)明的提取方法，并根據(jù)上述蘋果多酷含量的計(jì)算公式可W得 到蘋果果實(shí)中的多酷提取率，其含量為8020. 94ug，提取率為；85. 37%。相對(duì)現(xiàn)有的技術(shù)方 法，其提取率相對(duì)大大地提高。
[00財(cái) 實(shí)施例2
[0066] 具體的提取方法步驟與實(shí)施案例1基本上相同，不同的是：蘋果果實(shí)、丙麗、己醇 按固液比為1 ;60 ;60混合；在負(fù)壓為0. 5MPa，和800W的下進(jìn)行超聲波處理；所述每次超聲 波處理時(shí)間為2min。
[0067] 1.蘋果多酷的鑒定：
[006引將實(shí)施例2制備的蘋果多酷進(jìn)行如下鑒定：
[0069] 1)鑒定原理；薄層層析法（吸附色譜），吸附性薄層色譜法是將吸附劑在光潔的表 面上均勻地鋪成薄層，而后在在上面點(diǎn)上樣品，W流動(dòng)相開展，該樣樣品組分不斷地被吸附 劑吸附，而被流動(dòng)相溶解，解吸而向前移動(dòng)。由于吸附劑對(duì)不同組分有不同的吸附能力，流 動(dòng)相也有不同的解吸能力，因而流動(dòng)相在向前移動(dòng)的過程中，不同組分的物質(zhì)將被分開。如 果各組分本身有顏色則薄層板干燥后會(huì)出現(xiàn)一些列高低不同的斑點(diǎn)，如果本身沒有顏色， 則可用各種顯色方法使之顯色。
[0070] 2)測(cè)定方法；制備所需的層析板，將樣品在薄層上展開。
[0071] 3)測(cè)定結(jié)果；在薄層層板上出現(xiàn)一個(gè)淡黃色色斑，向其噴顯色劑，出現(xiàn)藍(lán)色。證明 所分離得到的產(chǎn)物為蘋果多酷類提取物。
[007引實(shí)施例3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
[0073] 具體的提取方法步驟與實(shí)施案例1基本上相同，不同的是：蘋果果實(shí)、丙麗、己醇 按固液比為1 ;30 ;30混合；在負(fù)壓為-0. 5MPa，和400W的下進(jìn)行超聲波處理；所述每次超聲 波處理時(shí)間為2min。
[0074] 將實(shí)施例2制備的蘋果多酷進(jìn)行如下動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：
[007引取昆明種小鼠50只（每只體重在20g-25g)，隨機(jī)分成5組誼白對(duì)照組（A組）、 模型對(duì)照組炬組）、蘋果多酷高、中、低H個(gè)劑量組（分別為E、D、C組）。將高劑量、中劑 量、低劑量各給藥組分組灌服用150、100、50mg/kg體重的蘋果多酷，對(duì)照組給予同體積蒸 觸水。6周后處死動(dòng)物，用生化的方法測(cè)定局部的SOD和HYP含量，其具體結(jié)果如下：
[0076] 分組 分?jǐn)?shù) S0D(NU/ing port) GSH-PX (皿ol/mg port) 空白對(duì)照組（A 組)~ To 302. 12 + 45. 17 20. 45 + 3. 65 模型對(duì)照組巧組)~ To 362. 56 + 43. 56 22.65 + 4.23 低劑量對(duì)照組（C 組）402. 64 + 46. 85 28. 39 + 8. 69 中劑量對(duì)照組化組）413. 92 + 41. 26 28. 19 + 4. 96 高劑量對(duì)照組化組）~ 409. 16 + 48. 92 27. 94 + 5. 62
[0077]
[007引 W上測(cè)試結(jié)果表明；A組與B組比較，P < 0. 05,證明兩者有顯著性差異。說明本 發(fā)明提供的方法提取的蘋果果實(shí)細(xì)胞提取物蘋果多酷的抗氧化能力強(qiáng)。
[0079] 從上述數(shù)據(jù)中可W看出D組和E組的小鼠紅細(xì)胞SOD活力明顯高于B組（P <0.05)，并且D組小鼠灌胃4周后紅細(xì)胞SOD活力和A組比較也有顯著性的提高（P < 0. 05)。而E組小鼠紅細(xì)胞活力與B組比較SOD活力有提高，但提高無顯著性差異（P > 0. 05)，并且C組與E組小鼠灌胃30天后紅細(xì)胞SOD活力及提高程度和空白對(duì)照組比較亦 無顯著性差別（P > 0. 05)。
[0080] 同時(shí)，蘋果多酷采用中劑量的效果是最好的，表格中SOD和GSH-ra分別是超氧化 物歧化酶和谷脫甘膚過氧化物酶，它們的主要作用清除機(jī)體內(nèi)存在的自由基、過氧化物和 輕自由基，從而防止機(jī)體的脂質(zhì)被氧化，進(jìn)而損傷細(xì)胞膜，引起炎癥，并促使機(jī)體衰老。因 此，SOD和GSH-PX的含量表達(dá)高，代表機(jī)體能夠很好地清除機(jī)體內(nèi)的該些有害物質(zhì)，從而保 持機(jī)體的肌膚水分充足、保持彈性的，同時(shí)，人體皮膚抗氧化能力的增強(qiáng)，能夠保持皮膚光 滑并去除臉部權(quán)皺。
[0081] 根據(jù)上述說明書的掲示和教導(dǎo)，本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員還可W對(duì)上述實(shí)施方 式進(jìn)行變更和修改。因此，本發(fā)明并不局限于上面掲示和描述的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的 一些修改和變更也應(yīng)當(dāng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。此外，盡管本說明書中使用 了一些特定的術(shù)語，但該些術(shù)語只是為了方便說明，并不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成任何限制。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種蘋果果實(shí)細(xì)胞提取物的提取方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 準(zhǔn)備蘋果果實(shí)； (2) 萃取：將蘋果果實(shí)、丙酮、乙醇按固液比為1:(30-60) :(30-60)混合；在壓強(qiáng)為 (-0. 5MPa)-0. 5MPa，400W-800W的條件下進(jìn)行多次超聲波處理；所述每次超聲波處理時(shí)間 為2-10min，得到提取液； (3) 離心與濃縮； (4) 采用XDA-5大孔吸附樹脂吸附解吸處理； (5) 濃縮。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蘋果果實(shí)細(xì)胞提取物的提取方法，其特征在于，步驟（1) 中將所述蘋果果實(shí)洗凈切塊，于鼓風(fēng)干燥箱中風(fēng)干后粉碎，過40-80目篩；步驟（2)中所 述蘋果果實(shí)、丙酮、乙醇的固液比為1 :50 :50,所述壓強(qiáng)為0.1 MPa，所述多次超聲處理為在 500W下進(jìn)行超聲波處理，每次時(shí)間間隔為0. 5-3分鐘。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蘋果果實(shí)細(xì)胞提取物的提取方法，其特征在于，步驟（2) 中丙酮與乙醇的用量比為1:1。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蘋果果實(shí)細(xì)胞提取物的提取方法，其特征在于，步驟（3) 中所述離心為將步驟（2)得到的提取液在轉(zhuǎn)速為2000-5000r/min下離心10-30min ;所述 濃縮為取離心后的上清液于30-60°C條件下，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法在0. 08-0. 12MPa下濃縮并 回收丙酮和乙醇。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種蘋果果實(shí)細(xì)胞提取物的提取方法，其特征在于，所述 轉(zhuǎn)速為4000r/min，所述濃縮為取離心后的上清液于50°C條件下用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法在 0. 08-0. 12MPa下濃縮并回收丙酮和乙醇。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蘋果果實(shí)細(xì)胞提取物的提取方法，其特征在于，步驟（4) 中所述XDA-5大孔吸附樹脂作為吸附處理柱，所述吸附處理柱中的pH值為4. 5 ;選用質(zhì)量 分?jǐn)?shù)為70-90%的乙醇溶液作為解吸劑，上料液流速為0. 5-1. 5ml/min ;將已吸附飽和的樹 月旨，選用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65% -90%的乙醇，以0. 5-2. Oml/min的速率和4-8BV的吸附流速進(jìn)行 洗脫；步驟（5)所述濃縮是在35°C下進(jìn)行真空濃縮，濃縮后的上清液用濾膜過濾后再濃縮。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種蘋果果實(shí)細(xì)胞提取物的提取方法，其特征在于，步驟（5) 所述濃縮后的上清液用〇. 22 μ M過濾，在凍干溫度為（-20)-(-35°C )，真空度為50-200Pa， 凍干時(shí)間為24-36小時(shí)進(jìn)行凍干處理，即得到蘋果果實(shí)細(xì)胞提取物凍干粉。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7任意一項(xiàng)所述的提取方法，所述蘋果果實(shí)細(xì)胞提取物為蘋果多 酚。
9. 權(quán)利要求1至8任意一項(xiàng)所述的提取方法制得的蘋果果實(shí)細(xì)胞提取物在護(hù)膚品中的 應(yīng)用。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于：所述護(hù)膚品為面膜、面霜、潔面乳、爽膚 水、乳液、精華素、眼霜。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種蘋果果實(shí)細(xì)胞提取物的提取方法及其應(yīng)用，所述方法包括如下步驟：(1)準(zhǔn)備蘋果果實(shí)；(2)萃?。簩⑻O果果實(shí)、丙酮、乙醇按固液比為1：(30-60)：(30-60)混合；在負(fù)壓為(-0.5MPa)-0.5MPa，和400W-800W的下進(jìn)行超聲波處理；所述每次超聲波處理時(shí)間為2-10min。(3)離心與濃縮；(4)采用XDA-5大孔吸附樹脂吸附解吸處理；(5)濃縮。本發(fā)明通過在負(fù)壓下采用超聲波結(jié)合混合溶劑的方法進(jìn)行提取，提高了萃取率；通過采用乙醇和丙酮作為萃取劑，對(duì)人體毒副作用較小且提高萃取率，所提取的蘋果果實(shí)細(xì)胞提取物具有抗氧化美容功效的效果。
【IPC分類】A61Q19-08, A61Q19-10, A61K8-97
【公開號(hào)】CN104622757
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510074122
【發(fā)明人】陳海佳, 王一飛, 葛嘯虎, 池詩(shī)源, 王小燕
【申請(qǐng)人】廣州賽萊拉干細(xì)胞科技股份有限公司
【公開日】2015年5月20日
【申請(qǐng)日】2015年2月11日