一種含自體外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的醫(yī)學(xué)美容產(chǎn)品的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種制備自體外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的方法以及通過所述方法獲得的含自體外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的醫(yī)學(xué)美容產(chǎn)品。特別地，本發(fā)明涉及采用自體外周血來源的富含血小板血漿和內(nèi)皮祖細(xì)胞，將獲取的自體內(nèi)皮祖細(xì)胞加入到富含血小板血漿中制備成生物美容制劑，富含血小板血漿促使內(nèi)皮祖細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞形成血管。同時(shí)提供了由自體內(nèi)皮祖細(xì)胞和自體血漿制備成醫(yī)學(xué)美容產(chǎn)品，可用于皮膚暗斑、粉刺瘢痕，以及燒傷、外傷引起的癥痕等修復(fù)改善。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，市場上已經(jīng)出現(xiàn)一些活細(xì)胞醫(yī)學(xué)美容產(chǎn)品，但這些活細(xì)胞來源多數(shù)為同源異體的。盡管皮膚免疫反應(yīng)低下，但是作為異體的活細(xì)胞應(yīng)用到皮膚上，還是容易發(fā)生過敏反應(yīng)，所以需要在應(yīng)用前進(jìn)行皮試，觀察兩個(gè)小時(shí)以上，無過敏反應(yīng)方可應(yīng)用。
[0003]內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在生理或病理因素刺激下，可從骨髓動(dòng)員到外周血參與損傷血管的修復(fù)。內(nèi)皮祖細(xì)胞主要來源骨髓，但骨髓采集需要麻醉且較痛苦，存在創(chuàng)傷，不易為人們接受。在人循環(huán)血液中已經(jīng)證明存在內(nèi)皮祖細(xì)胞，可以分化成內(nèi)皮細(xì)胞和/或平滑肌細(xì)胞，其主要功能是參與血管新生。表皮和真皮層細(xì)胞之所以能使得皮膚保持活力，主要是因?yàn)槠つw中毛細(xì)血管提供了足夠的養(yǎng)分，促使細(xì)胞不斷增殖、分裂和分化，新生細(xì)胞增多，使皮膚增厚，逐漸恢復(fù)皮膚正常結(jié)構(gòu)和生理功能。
[0004]本發(fā)明利用外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞及其血管生成的功能，配合富含血小板血漿中大量細(xì)胞因子和營養(yǎng)成分，有效令內(nèi)皮祖細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，應(yīng)用到皮膚中形成新生血管，保持皮膚豐富的營養(yǎng)成分，促使細(xì)胞不斷增殖、分裂和分化。特別是，對于皮膚暗斑、粉刺瘢痕，以及燒傷、外傷引起的疤痕等，具有良好修復(fù)作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了促使皮膚新生細(xì)胞增多，使皮膚增厚，逐漸恢復(fù)皮膚正常結(jié)構(gòu)和生理功能，本發(fā)明利用自體外周血來源富含血小板血漿和內(nèi)皮祖細(xì)胞的生物學(xué)作用，可以有效地促使內(nèi)皮祖細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，形成新生毛細(xì)血管，為皮膚供應(yīng)充足養(yǎng)分。本發(fā)明通過采集抗凝外周血獲得自體血漿，抗凝外周血來源單核細(xì)胞培養(yǎng)獲得內(nèi)皮祖細(xì)胞。自體血漿富含血小板和富含各種生長因子，其中成纖維細(xì)胞生長因子:激發(fā)新活細(xì)胞，加速組織修復(fù)；表皮生長因子:修復(fù)上皮細(xì)胞，加速血管生長，加快組織修復(fù)；轉(zhuǎn)化生長因子:促進(jìn)血管上皮細(xì)胞修復(fù)再生；血小板衍生生長因子:產(chǎn)生膠原蛋白，促進(jìn)血管生長，激活細(xì)胞再生；血管內(nèi)皮生長因子:強(qiáng)力修復(fù)組織，產(chǎn)生膠原蛋白，刺激產(chǎn)生透明質(zhì)酸。
[0006]本發(fā)明中內(nèi)皮祖細(xì)胞存在骨髓和外周血中，加速新生血管的形成，完善組織的血液循環(huán)，改善組織的血供，最終達(dá)到防止組織缺血壞死。內(nèi)皮祖細(xì)胞可以直接作用于終末血管，增加皮瓣局部毛細(xì)血管及小靜脈的數(shù)量和總面積，以增加皮片及隨意皮瓣的成活面積。燒傷、外傷等引起的疤痕，內(nèi)皮祖細(xì)胞可以加速創(chuàng)傷愈合的速度，減少瘢痕增生的發(fā)生，促進(jìn)脂肪細(xì)胞增殖和存活。內(nèi)皮祖細(xì)胞通過對血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用，促進(jìn)皮膚組織不斷形成新的毛細(xì)血管，供應(yīng)充足營養(yǎng)，使得成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等不斷增殖、分裂和分化，新生細(xì)胞增多，使皮膚增厚，逐漸恢復(fù)皮膚正常結(jié)構(gòu)和生理功能。
[0007]本發(fā)明提供了一種含自體外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的醫(yī)學(xué)美容產(chǎn)品的制備方法，其中，所述方法包括通過從自體外周血中獲取富含血小板血漿和培養(yǎng)獲得自體內(nèi)皮祖細(xì)胞，將獲取的自體內(nèi)皮祖細(xì)胞加入到自體血漿中制備成生物美容制劑。
[0008]所述自體內(nèi)皮祖細(xì)胞高表達(dá)其特異性標(biāo)志物；所述自體內(nèi)皮祖細(xì)胞高表達(dá)CD34、⑶133和FLK-1分子；所述自體內(nèi)皮祖細(xì)胞高表達(dá)⑶34+彡90 ⑶133+彡90 %和FLK-1+ 彡 80%。
[0009]本發(fā)明提供了的富含血小板血漿由抽取人自體抗凝外周血，經(jīng)兩次離心去除紅細(xì)胞和白細(xì)胞后獲得的富含血小板血漿，放置4°C冰箱存放備用。
[0010]本發(fā)明提供了的自體內(nèi)皮祖細(xì)胞，其特征在于由離心獲取自體血漿后的血細(xì)胞，經(jīng)Ficoll密度分離液離心獲得單核細(xì)胞，用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(EGM-2)(含2%胎牛血清、10U/ml肝素、12yg/ml牛腦提取物、10ng/ml重組人表皮生長因子、I μ g/ml氫化可的松、50ng/ml重組人血管內(nèi)皮生長因子、50ng/ml重組人R3-胰島素樣生長因子-1和50ng/ml重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子-β )重懸，按5Χ 16細(xì)胞/ml加入到重組人纖連蛋白包被的25cm2培養(yǎng)瓶中5ml，于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中生長48小時(shí)。
[0011]48小時(shí)后對培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行換液，用5ml移液管吸棄培養(yǎng)液，加入5ml新鮮的EGM-2 (含2%胎牛血清、10U/ml肝素、12 μ g/ml牛腦提取物、10ng/ml重組人表皮生長因子、I μ g/ml氫化可的松、50ng/ml重組人血管表皮生長因子、50ng/ml重組人R3-胰島素樣生長因子-1和50ng/ml重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子-β )，重組人纖連蛋白包被的25cm2培養(yǎng)瓶中繼續(xù)在37°C，5% CO 2培養(yǎng)箱中生長，每隔2天換一次新鮮培養(yǎng)液。
[0012]內(nèi)皮祖細(xì)胞在25cm2培養(yǎng)瓶中生長融合達(dá)到80%以上，用5ml移液管吸棄培養(yǎng)液，加入0.5ml 0.25% (質(zhì)量體積比)胰酶(含質(zhì)量體積比0.01 % EDTA)消化后1000轉(zhuǎn)每分鐘離心5分鐘收集內(nèi)皮祖細(xì)胞；用5ml移液管加入1ml新鮮的EGM-2 (含2%胎牛血清、10U/ml肝素、12 μ g/ml牛腦提取物、10ng/ml重組人表皮生長因子、I μ g/ml氫化可的松、50ng/ml重組人血管表皮生長因子、50ng/ml重組人R3-胰島素樣生長因子-1和50ng/ml重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子-β )，加入到I瓶用纖連蛋白包被的75cm2培養(yǎng)瓶中繼續(xù)在370C ,5% 0)2培養(yǎng)箱中生長，每隔2天換一次新鮮培養(yǎng)液。如此連續(xù)傳代1-5 (優(yōu)選連續(xù)傳代3代)代培養(yǎng)經(jīng)胰酶消化離心后，獲得4X 17以上的內(nèi)皮祖細(xì)胞，用4ml生理鹽水重懸，計(jì)數(shù)，即獲得內(nèi)皮祖細(xì)胞，放置冰箱4°C存放備用。
[0013]所述自體內(nèi)皮祖細(xì)胞高表達(dá)其特異性標(biāo)志物，其表型檢測方法為:取苔盼蘭染色計(jì)數(shù)后的2 X 16細(xì)胞，分兩組，第一組分別添加到有20 μ L FITC標(biāo)記鼠抗人FLK-1單抗、20 μ LPE標(biāo)記鼠抗人⑶133單抗和20 μ L Percp標(biāo)記鼠抗人⑶34單抗；第二組為同型對照，分別添加到有20 μ L FITC標(biāo)記鼠IgGl、20 μ L PE標(biāo)記鼠IgGl和20 μ L PerCP標(biāo)記鼠IgGl ;置于4°C冰箱染色30分鐘，然后用ImL的IX磷酸鹽緩中液洗滌三次，最后用0.5mL的IXPBS重懸洗滌后的細(xì)胞，所得洗滌后的細(xì)胞用FACSCalibur臨床型流式細(xì)胞儀檢測，所述自體內(nèi)皮祖細(xì)胞高表達(dá)CD34+彡90%、CD133+彡90%和FLK-1+彡80%。
[0014]所述自體內(nèi)皮祖細(xì)胞可用40%內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)液、10%二甲基亞砜和50%胎牛血清組成的凍存液，儲存在_196°C液氮罐中，以備今后復(fù)蘇后使用。
[0015]本發(fā)明還提供了一種含自體外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的醫(yī)學(xué)美容產(chǎn)品，其中，該產(chǎn)品主要由如下成分組成:
[0016]I) 5ml自體富含血小板血漿；
[0017]2) 5 X 16自體內(nèi)皮祖細(xì)胞；
[0018]裝入1ml無菌的密封塑料針管中，共5ml，包裝后形成產(chǎn)品，可保存在4°C冰箱條件下，保質(zhì)期為24小時(shí)。
[0019]本發(fā)明提供了含有自體血漿和自體內(nèi)皮祖細(xì)胞的醫(yī)學(xué)美容產(chǎn)品，
[0020]通過本發(fā)明的方法，通過獲取的富含血小板血漿和自體內(nèi)皮祖細(xì)胞制備成的醫(yī)學(xué)美容制劑。由本發(fā)明提供的方法得到含有自體富含血小板血漿和自體內(nèi)皮祖細(xì)胞的醫(yī)學(xué)美容產(chǎn)品，能夠?qū)ζつw暗斑、粉刺瘢痕，以及燒傷、外傷引起的疤痕等產(chǎn)生良好修復(fù)和填充作用，以及具有祛皺、抗氧化、皮膚修復(fù)、除斑和抗衰老。
【附圖說明】
[0021]圖1表示由實(shí)施例1所培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞圖片。
[0022]圖2表示由實(shí)施例1所培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞流式細(xì)胞圖片。
[0023]圖3表示36歲男性經(jīng)含自體內(nèi)皮祖細(xì)胞的醫(yī)學(xué)美容制劑I個(gè)療程美容前后外傷疤痕改善的圖片。
【具體實(shí)施方式】
[0024]本發(fā)明提供了一種含自體外