冰片與葉酸共修飾的阿霉素聚酰胺-胺納米遞藥系統(tǒng)的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明基于聚酰胺-胺（poly(amidoamine)，PAMAM)樹形大分子，通過化學合成 葉酸（Folicacid，F(xiàn)A)介導的、冰片（Borneol，B0)修飾的新型納米載體（FA-BO-PAMAM)， 并包載抗癌藥物（Doxorubicin，D0X)，制備冰片與葉酸共修飾的阿霉素聚酰胺-胺納米遞 藥系統(tǒng)。
【背景技術】
[0002] 腦膠質瘤是顱內常見的發(fā)生于神經(jīng)外胚層的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率提升，每1 萬人中有5-10個人，占原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的40%。目前臨床上腦膠質瘤治療以手術 為主，并結合放療、化療等措施綜合治療。然而手術因顱內禁區(qū)多難以徹底清除病灶，加之 腫瘤浸潤性生長，極易復發(fā)；放療因劑量難以控制，易引起不可逆的顱內損傷及誘發(fā)繼發(fā)性 惡性腫瘤，使得藥物治療日益顯得重要。然而，由于血腦屏障的存在，臨床上大多數(shù)的藥物 難以透過入腦。為此研宄者嘗試了多種腦靶向策略以增加藥物的入腦遞送，達到治療腦部 疾病的作用。另外，腦組織是人體的中樞，藥物入腦之后若到達非腦膠質瘤部位，藥物濃度 降低的同時還可能產(chǎn)生更嚴重的中樞系統(tǒng)副作用，因此，開發(fā)一種特定的載體既能跨越BBB 又能靶向至腫瘤部位是非常必要的。
[0003] 聚酰胺-胺（PAMAM)是一類合成的、單分散的納米級大分子化合物，具有高度枝 化，結構可控，單分散性等特點。作為藥物載體，PAMAM具有以下幾個優(yōu)點：（1)表面有大量 的官能團可以連接藥物分子，靶向分子或者成像劑。（2)內部具有較大的空腔可以包埋藥物 分子。（3) PAMAM的粒徑較小，是一種納米材料，近年來納米材料在腫瘤領域的應用比較廣 泛。然而，高代數(shù)的PAMAM末端具有大量的氨基，在生理pH下氨基易質子化，有一定的細胞 毒性。采用PEG修飾PAMAM是一種非常常見的方法來減輕細胞毒性。另外，用脂肪酸修飾 PAMAM也可以降低毒性，有報道曾用月桂酰來修飾PAMAM。但是沒有報道顯示以上修飾在降 低毒性的同時具有促血腦屏障開放的作用，另外這些修飾雖然降低了細胞毒性，但是也減 弱了細胞對藥物的攝取能力。
[0004] 冰片是一種傳統(tǒng)的中藥。中醫(yī)理論中冰片具有"引藥上行"的作用，另外現(xiàn)代研宄 表明冰片與藥物共用或者冰片與納米粒共用具有促進藥物入腦遞送的作用。這為本項目選 擇冰片共價偶聯(lián)到PAMAM表面達到促血腦屏障開放的作用提供了可能性。葉酸是一種廣泛 應用于腫瘤靶向的水溶性維生素，葉酸受體高表達于腫瘤組織，在正常組織中的表達相對 較少，關于葉酸作為腫瘤靶向配體的研宄已十分廣泛。從而我們構建了以冰片作為促血腦 屏障開放的功能基，葉酸作為腫瘤靶向分子的新型藥物載體FA-BO-PAMAM。大量冰片修飾 PAMAM載體在減輕載體本身表面的氨基濃度降低其細胞毒性的基礎上具有促血腦屏障開放 增加腦內皮細胞攝取的作用，同時葉酸的修飾增加了腫瘤細胞的攝取能力，從而達到減輕 藥物載體毒性、促血腦屏障開放和靶向至腦膠質瘤的三重作用，構建了 PAMAM作為腦膠質 瘤靶向的新思路。
[0005] 阿霉素是一種蒽環(huán)類抗生素，抗腫瘤譜廣，在臨床上被廣泛地應用于乳腺癌、肺 癌、膀胱癌等各種癌癥的治療。但是由于阿霉素對心臟、腎等臟器的毒副作用限制了其進一 步的臨床應用，因此研宄者將阿霉素作為模型藥物用于考察制劑或給藥系統(tǒng)的效果。有研 宄表明，阿霉素能夠誘導腦膠質瘤的凋亡，但是由于血腦屏障的存在，阿霉素難以透過入腦 且體內消除快，經(jīng)全身給藥后在腫瘤部位的蓄積量難以達到治療量，所以對于治療腦膠質 瘤效果不理想。若能使阿霉素在腫瘤部位的蓄積量達到治療量，對臨床腦膠質瘤治療具有 一定的前景。因此我們選擇阿霉素作為模型藥物，制備了冰片和葉酸共修飾的阿霉素聚酰 胺-胺納米遞藥系統(tǒng)（FA-BO-PAMAM/DOX)。目前尚沒有使用冰片和葉酸共修飾的阿霉素聚 酰胺-胺用于腦部疾病治療的報道。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種基于聚酰胺-胺樹形大分子（PAMAM)，通過化學合成 葉酸（FA)介導的、冰片（BO)修飾的新型納米載體并包載抗癌藥物阿霉素（DOX)的制備方 法，初步研宄此遞藥系統(tǒng)的血腦屏障開放能力和對腦膠質瘤的治療作用。
[0007] 為了實現(xiàn)上述技術目的，本發(fā)明采用了以下技術方案：
[0008] 冰片與葉酸共修飾的阿霉素聚酰胺_胺納米載藥系統(tǒng)的合成方法，主要包括以下 步驟：
[0009] (1)冰片丁二酸酐活性酯（BO-SA-NHS)的合成：稱取丁二酸酐（Succinic anhydride) 2. 0g溶于50mL無水二氯甲燒中，加入等摩爾的DMAP和三乙胺，另外稱取500mg 冰片（Borneol)溶于無水二氯甲烷后，逐滴加入到上述溶液中，室溫下油浴反應2天；取反 應所得的產(chǎn)物30mg溶于DMF中，5倍當量的EDC和NHS溶于PBS加入到上述反應液中，室溫 下活化反應2h ;反應結束后，通過正己烷多次萃取獲得活性酯產(chǎn)物；
[0010] (2) B0-PAMAM的合成：稱取10mg PAMAM G5溶液溶于2mL超純水中，逐滴加入到步 驟（1)合成的活性酯的DMF溶液中，室溫過夜反應；反應結束后，將反應液轉移到透析袋中， 用超純水透析24h，將透析完的溶液凍干得到白色固體產(chǎn)物；
[0011] (3) FA-BO-PAMAM的合成：稱取葉酸2mg溶于4mL DMF和DMS0的混合溶液中，DMF 和DMS0的體積比為3:1，加入5倍當量的EDC，室溫下活化反應3h ;將活化的反應液逐滴加 入到PAMAM的水溶液中，反應24h ;反應結束后，用水透析12h，將透析液凍干得到黃色的固 體產(chǎn)物；
[0012] (4)阿霉素聚酰胺-胺納米載藥系統(tǒng)的制備：準確稱取鹽酸阿霉素lmg，溶解于2mL DMS0和3倍當量的三乙胺的混合溶劑中，室溫攪拌過夜，使鹽酸阿霉素脫鹽酸成疏水性藥 物阿霉素；將上述經(jīng)預處理的阿霉素混合溶液逐滴加入到含l〇mg步驟3所得FA-BO-PAMAM 的lmL DMS0溶液中，避光反應24h ;反應結束后，向反應液中加入10mL超純水，再用乙酸乙 酯多次萃取除去游離的阿霉素，冷凍干燥后得到深紅色的凍干品。
[0013] 通過1H-NMR驗證載體（FA-BO-PAMAM)的合成以及確定連接到PAMAM表面的冰片和 葉酸分子的數(shù)目分別為40和5。經(jīng)透射電鏡（transmission electron microscope, TEM) 和納米粒度-電位分析儀分別對藥物載體的形貌、粒徑和表面電勢的測量，藥物載體呈類 球形，大小分布均勻，B0-PAMAM的粒徑為（14. 61±4. 14)nm，Zeta電位為（11. 47±0. 46)mV， FA-BO-PAMAM 的粒徑為（22. 28±0. 42)nm，Zeta 電位為（7. 6±0. 89)mV。經(jīng)紫外分光光度 計測定載體復合物的載藥量為（6. 64 ±0.09)%，包封率為（64. 58 ±0.85) %。透析法考察 FA-BO-PAMAM/DOX復合物在磷酸緩沖鹽（pH 7. 4和pH 5. 5)中的體外釋藥行為顯示其體外 釋放相比于原藥具有明顯的緩釋作用且具有一定的pH敏感性。
[0014] 本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：本發(fā)明采用冰片和葉酸共修飾的PAMAM載體包載抗腫 瘤藥物鹽酸阿霉素，制備遞藥系統(tǒng)（FA-BO-PAMAM/DOX)，可以有效地降低PAMAM表面的毒 性，可以有效的促進D0X跨過BBB模型而提高對腦膠質瘤的抑制作用，對C6腦膠質