具有可追蹤性的聚乙烯亞胺/層片狀羥基磷灰石/五-氟尿嘧啶/dna復(fù)合物的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域，涉及用于癌癥治療的ー種具有可追蹤性DNA信號(hào) 的二維響應(yīng)型納米載藥體系及其制備方法，具體涉及ー種以響應(yīng)型層片狀羥基磷灰石為載 體的具有可追蹤性DNA"[目號(hào)的響應(yīng)型載藥體系的制備。
【背景技術(shù)】
[0002] 在腫瘤治療領(lǐng)域，納米載藥系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)抗癌藥物的靶向和緩釋治療。與游離藥物 相比，藥物緩釋體系可以顯著提高藥物療效、減少給藥劑量以及降低毒性反應(yīng)。目前，二維 納米層片狀的藥物載體由于其優(yōu)良的藥物裝載、保護(hù)和緩釋性能受到了廣泛關(guān)注。但是具 有可識(shí)別的DNA信號(hào)標(biāo)志的二維響應(yīng)型納米載藥體系還未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供具有插層結(jié)構(gòu)的層片狀羥基磷灰石/ 五-氟尿嘧啶復(fù)合物及相關(guān)的聚乙烯亞胺/層片狀羥基磷灰石/五-氟尿嘧啶復(fù)合物和具 有可追蹤性的聚乙烯亞胺/層片狀羥基磷灰石/五-氟尿嘧啶/DNA復(fù)合物。
[0004] 本發(fā)明中的藥物載體一一層片狀羥基磷灰石作為ー種非病毒基因載體，它具有成 本低，制備エ藝簡單，能對腫瘤組織微環(huán)境做出響應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)與結(jié)構(gòu)類似的天然層狀無 機(jī)載體（諸如蒙脫土和水滑石等）相比，層片狀羥基磷灰石具有優(yōu)異的生物相容性和較高 的藥物裝載能力，是極具潛力的藥物基因載體材料。同時(shí)，環(huán)境敏感型層片狀羥基磷灰石載 藥體系能對腫瘤組織微環(huán)境做出響應(yīng)，這樣就能夠有效的將藥物帶到病灶部位，在腫瘤組 織特殊環(huán)境的刺激下，迅速的釋放藥物，以減少藥物對正常組織的毒副作用，更好地發(fā)揮藥 效。本發(fā)明利用具有標(biāo)記作用的質(zhì)粒DNA可以有效追蹤響應(yīng)型層片狀羥基磷灰石（HAp)載 藥體系的迀移過程、層片狀羥基磷灰石層間距較大并對陰離子藥物具有高裝載能力以及聚 乙烯亞胺（PEI)具有提高載體轉(zhuǎn)染能力的特點(diǎn)，制備了具有可追蹤性的聚乙烯亞胺/層片 狀羥基磷灰石/五-氟尿嘧啶/DNA復(fù)合物，可用于癌癥治療。
[0005] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的ー種具有插層結(jié)構(gòu)的層片狀羥基磷灰石/ 五-氟尿嘧啶復(fù)合物的制備方法，包括以下步驟：
[0006] 步驟一、制備層片狀羥基磷灰石：以醇水比為2:1配制濃度為llmg/ml的十二烷 基磺酸鈉溶液，然后將其加入一玻璃容器中，用磁力撹拌器在60°C撹拌均勻；配制3. 3mol/ L的硝酸鈣水溶液，配置lmol/L的磷酸氫二銨溶液，其中，醇水比為1: 1，按照硝酸鈣水溶 液與磷酸氫二銨溶液體積比為1:2撹拌均勻后先后加入到上述玻璃容器中；隨后，向上述 玻璃容器中加入2. 5mol/L的氫氧化鈉溶液，其中，醇水比為1:1，自室溫勻速升溫至80~ 85°C，回流反應(yīng)14h;將玻璃容器封ロ后在室溫下沉積12天；用去離子水清洗后靜置3天； 離心去除多余水分，在60°C干燥，即得層片狀納米羥基磷灰石粉末；
[0007] 步驟二、將步驟一中制備的層片狀羥基磷灰石加入到濃度為2mg/ml、pH為8~13 的氫氧化鈉溶液中形成混合溶液A，將所述混合溶液A超聲振蕩10~15min后，并在撹拌中 升高至60°C;隨后向混合溶液A中加入五-氟尿嘧啶，其中，五-氟尿嘧啶與層片狀羥基磷 灰石的質(zhì)量比為1 :1~8 ;反應(yīng)8h后離心，使上清液與沉淀分離，將沉淀物在60°C下干燥后 研磨，從而形成具有插層結(jié)構(gòu)的層片狀羥基磷灰石/五-氟尿嘧啶復(fù)合物。
[0008] 在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明還提出了一種聚乙烯亞胺/層片狀羥基磷灰石/五-氟尿嘧 啶復(fù)合物的自卑方法，是將上述制備得到的層片狀羥基磷灰石/五-氟尿嘧啶復(fù)合物加入 到2~8mg/ml、分子量為1800~20000的聚乙烯亞胺水溶液中形成混合溶液B，所述混合 溶液B的濃度為2. 5mg/ml，室溫下攪拌8~16h，萬轉(zhuǎn)離心5~IOmin后，去除上清液，將沉 淀物置于鼓風(fēng)干燥箱中吹干，研磨后即為聚乙烯亞胺/層片狀羥基磷灰石/五-氟尿嘧啶 復(fù)合物。
[0009] 本發(fā)明最主要的是提出了ー種具有可追蹤性的聚乙烯亞胺/層片狀羥基磷灰石/ 五-氟尿嘧啶/DNA復(fù)合物的制備方法，其步驟包括：將50mg上述制備得到的粉末狀的聚こ 烯亞胺/層片狀羥基磷灰石/五-氟尿嘧啶復(fù)合物加入到19ml滅菌高純水的錐形瓶中，超 聲分散5min，制備得到懸濁液；然后，將Iml質(zhì)量濃度為lmg/ml的DNA溶液逐滴加入到的 懸濁液中，邊加邊震蕩；最終，將混合液放入25°C恒溫?fù)u床中搖動(dòng)，轉(zhuǎn)速為150rpm，每搖動(dòng) 0. 3h，平衡吸附lh，重復(fù)6次上述的搖動(dòng)-平衡吸附過程；靜置吸附24h，即獲得具有可追蹤 性的聚乙烯亞胺/層片狀羥基磷灰石/五-氟尿嘧啶/DNA復(fù)合物。
[0010] 本發(fā)明中制備得到的層片狀羥基磷灰石/五-氟尿嘧啶復(fù)合物和聚乙烯亞胺/層 片狀羥基磷灰石/五-氟尿嘧啶復(fù)合物均可用于藥物緩釋。本發(fā)明中制備得到的具有可追 蹤性的聚乙烯亞胺/層片狀羥基磷灰石/五-氟尿嘧啶/DNA復(fù)合物可以用于癌癥治療中。
[0011] 本發(fā)明具有可追蹤性的聚乙烯亞胺/層片狀羥基磷灰石/五-氟尿嘧啶/DNA復(fù) 合物是以響應(yīng)型層片狀羥基磷灰石作為藥物載體，攜帶熒光蛋白基因的質(zhì)粒DNA作為藥物 載體的追蹤信號(hào)，利用基因轉(zhuǎn)染及影像學(xué)原理，最終實(shí)現(xiàn)利用載藥體系發(fā)出的熒光信號(hào)了 解藥物載體的移動(dòng)過程。與其他載藥體系相比本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0012] 1.本發(fā)明提供的熒光蛋白標(biāo)記的DNA作為層片狀羥基磷灰石載藥體系的標(biāo)記信 號(hào)，能夠使二維藥物載體具有可追蹤性，通過對熒光位置的定位和分析，可以有效表征藥物 載體的作用部位并評價(jià)其有效性。
[0013] 2.本發(fā)明提供的層片狀羥基磷灰石作為藥物載體，生物相容性良好，相比于天然 層狀無機(jī)載體具有較大的層間距，對于陰離子藥物具有較高的裝載能力，同時(shí)形成的載藥 復(fù)合物具有插層結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了對陰離子藥物的有效保護(hù)與可控釋放。
[0014] 3.本發(fā)明提供的層片狀羥基磷灰石載藥復(fù)合物具有對腫瘤組織微環(huán)境具有響應(yīng) 能力，可以實(shí)現(xiàn)對藥物的可控釋放。
[0015] 4.本發(fā)明提供的聚乙烯亞胺改性后的載藥復(fù)合物負(fù)載質(zhì)粒DNA，可以有效跟蹤藥 物載體進(jìn)入細(xì)胞并及時(shí)做出響應(yīng)，這對于載藥體系在癌癥治療中的應(yīng)用具有重要意義。
【附圖說明】
[0016] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例2制備得到的具有插層結(jié)構(gòu)的層片狀羥基磷灰石/五-氟尿 嘧啶復(fù)合物的體外藥物釋放曲線圖；
[0017] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1-3制備得到的具有插層結(jié)構(gòu)的層片狀羥基磷灰石/五-氟 尿嘧啶復(fù)合物的熱失重曲線；
[0018] 圖3為為本發(fā)明實(shí)施例3在制備具有插層結(jié)構(gòu)的層片狀羥基磷灰石/五-氟尿嘧 啶復(fù)合物過程中載藥前、后層片狀羥基磷灰石的X射線衍射圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)ー步詳細(xì)描述，所描述的具體 實(shí)施例僅僅對本發(fā)明進(jìn)行解釋說明，并不用以限制本發(fā)明。
[0020] 本發(fā)明是以具有熒光標(biāo)記的質(zhì)粒DNA作為層片狀羥基磷灰石載藥體系的追蹤信 號(hào)。以五-氟尿嘧啶作為模型藥物，載藥復(fù)合物經(jīng)聚乙烯亞胺改性后可成功負(fù)載DNA信號(hào)， 從而定位藥物載體的作用位置。
[0021] 實(shí)施例1、制備具有插層結(jié)構(gòu)的層片狀羥基磷灰石/五-氟尿嘧啶復(fù)合物，包括以 下步驟：
[0022] 步驟一、制備層片狀羥基磷灰石：
[0023] 稱取0.5g十二烷基磺酸鈉，加入燒瓶中，然后加入15ml去離子水和30ml無水こ 醇，配制出濃度為llmg/ml的十二烷基磺酸鈉溶液，用磁力攪拌器在60°C攪拌均勾；
[0024] 配制15ml濃度為3. 3mol/L的硝酸鈣水溶液，攪拌均勻后加入上述燒瓶中；加入 30ml濃度為lmol/L的磷酸氫二按水溶液和30ml無水こ醇；隨后，加入20ml濃度為2. 5mol/ L的氫氧化鈉水溶液和20ml無水こ醇，自室溫勻速升溫至80~85°C，回流反應(yīng)14h。將反 應(yīng)物倒入另外ー燒杯中，封ロ后在室溫下沉積12天；用去離子水清洗后靜置3天；離心去 除多余水分，在60°C干燥，即得層片狀納米羥基磷灰石粉末；
[0025] 步驟二、取0.Ig由步驟ー制備得到的層片狀羥基磷灰石溶于50mlpH= 13的氫 氧化鈉溶液中，超聲振蕩IOmin后，在攪拌中將溫度升高至60°C;隨后向該混合溶液中加入 0.2g的五-氟尿嘧啶（5-FU)，反應(yīng)8h后離心，使上清液與沉淀分