一種有效滅活凝血酶原復(fù)合物中細(xì)小病毒方法及獲得的制劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及血漿制品領(lǐng)域，具體涉及ー種有效滅活凝血酶原復(fù)合物中細(xì)小病毒方 法及獲得的制劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 凝血酶原復(fù)合物（ProthrombinComplexConcentrate，PCC)，它含有凝血因子IX、II、x、及少量其他血漿蛋白。主要用于預(yù)防和治療因凝血因子ii、w、ix及X缺乏導(dǎo)致的出 血，如乙型血友病、嚴(yán)重肝病及彌散性血管內(nèi)凝血（DIC)等，還可用于逆轉(zhuǎn)抗凝劑（如香豆 素類、茚滿二酮等）誘導(dǎo)的出血，對已產(chǎn)生凝血因子W抑制性抗體的甲型血友病患者也有 作用。
[0003] 凝血酶原復(fù)合物是多種凝血因子組成的復(fù)合物，是ー種特殊的血液制品。由于 血液制品來源于人血漿，通常由多人份血漿混合后經(jīng)特定分離純化技術(shù)制備而成，理論上 經(jīng)血液傳播的疾病也可經(jīng)血液制品傳播，目前，常見的血液制劑攜帶并傳播的病毒主要有 HBV、HCV、HIV和HTLV-1、CMV、EBV、HAV、細(xì)小病毒等。
[0004] 為了提高血液制品的安全性，根據(jù)相關(guān)指導(dǎo)原則要求，血液制品生產(chǎn)エ藝要具有 一定的去除/滅活部分病毒能力，生產(chǎn)過程中應(yīng)有特定的去除/滅活病毒方法，同時，全球 公認(rèn)的有效的滅活病毒效果應(yīng)該達(dá)到4.Olog以上，我國監(jiān)管部門也嚴(yán)格要求干熱處理工 藝滅活豬細(xì)小病毒PPV達(dá)到4.Olog以上。
[0005] 血液制品病毒滅活方法分為物理滅活方法和化學(xué)滅活方法，物理滅活方法通常有 巴氏消毒法、干熱法、Y射線輻照法、短波紫外線法，化學(xué)方法通常有有機溶剤/去污劑（s/ D)處理法、低pH值孵放法、辛酸滅活法、光化學(xué)法?；瘜W(xué)滅活方法僅對脂包膜病毒有較好的 效果，而對非脂包膜病毒的效果微乎其微，且化學(xué)滅活方法中需要添加ー種或多種生化試 齊U，其長期安全性還須驗證。（宋清爽等，"血液制品病毒滅活及去除エ藝進(jìn)展"，生物技木通 訊，2012年04期）。大多數(shù)生物制品大都采用真空冷凍干燥的方法制成終制品，干熱滅活 法是較為可行的終端滅活方式。
[0006] 目前，干熱滅活通常采用80°C處理72小時，或KKTC處理30分鐘的エ藝。其中， 80°C處理72小時的干熱滅活エ藝，成本高，各種凝血因子活性損失大；盡管KKTC處理30 分鐘的干熱滅活エ藝，成本雖低，但事實上病毒滅活效果卻不佳，特別是難以有效滅活細(xì)小 病毒（如PPV)，Kim等報道100°C水浴30min處理，僅使PPV(豬細(xì)小病毒）的滴度下降了 I. 901og。項慶軍等在"最終干熱處理對凝血因子濃縮劑中非包膜病毒的作用"中報道，采 用90°CIOhr的干熱滅活エ藝，對CPV(犬細(xì)小病毒）滅活僅2.Ilog(國外醫(yī)學(xué).預(yù)防.診 斷.治療用生物制品分冊，1995年06期）。
[0007] 另外，因凝血酶原復(fù)合物不穩(wěn)定，分離純化時，需在最終配制時加入保護(hù)劑，使產(chǎn) 品能耐受凍干及干熱處理。目前，為了保證凝血酶原復(fù)合物的最終效價，需要同時加入多 種干熱保護(hù)劑，成本也較高。若采用單一千熱保護(hù)劑，則保護(hù)效果不佳，難以保證凝血酶原 復(fù)合物的效價，如，公開號=1524578的專利申請公開了ー種在凝血酶原復(fù)合物溶液中加入 精氨酸等作為干熱保護(hù)劑的方法，其中，精氨酸的加入量可以為〇. 1%~5%，優(yōu)選為0. 5% 和1%，且必須聯(lián)合使用甘氨酸和或蔗糖，但是，申請人實際應(yīng)用時，發(fā)現(xiàn)其對凝血酶原復(fù)合 物的保護(hù)效果并不理想，尤其是在同甘氨酸和或蔗糖配伍時，干熱處理后制品顏色變黃，復(fù) 溶外觀差，有蛋白絮狀物析出，可見異物不合格，而且人凝血因子的活性回收率不高，尤其 是因子II、VII回收率不理想。申請人試驗還發(fā)現(xiàn)采用80°C處理72h的方式，人凝血因子 IX的活性損失高達(dá)約20%，這ー結(jié)果與王益壽等研究結(jié)果一致（中國輸血雜志1998年第 11卷第4期P195,人凝血酶原復(fù)合物的病毒滅活與驗證）。所以，公開文獻(xiàn)采用80°C處理 72h的方式難以保證本發(fā)明產(chǎn)品的效價回收率，而采用KKTC處理30min不能保證耐熱非脂 包膜病毒（如PPV)的安全性（SantagostinoE.etal.，"TransmissionofParvovirus B19byCoagulationFactorConcentratesexposedto100DegreesしHeatAfter Lyophilization，，'Transfusion37 (5)，517 - 522(May1997)。
[0008] 改進(jìn)凝血酶原復(fù)合物干熱處理工藝，以確保滅活病毒效果達(dá)標(biāo)，而且要保證理化 性質(zhì)合格（特別是復(fù)溶外觀，可見異物）和生物學(xué)活性（尤其是FIX和FII、FVII、FXI活性 回收率）、以及維持有效期內(nèi)的穩(wěn)定性是十分必要和迫切的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明提供了一種新的高效滅活凝血酶原復(fù)合物中細(xì)小病毒PPV的方法及獲得 高度穩(wěn)定的凝血酶原復(fù)合物制劑的制備方法，以及該方法制得的凝血酶原復(fù)合物制劑。
[0010] 申請人通過試驗驚訝地發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明80°C處理4h，再在KKTC處理30~ 60min的干熱滅活方式，可以有效保證產(chǎn)品的外觀和效價回收率，其中，80°C處理4h，再在 100°C處理30min的方式，效價回收率最高（97. 8% )，而80°C處理4h，再在KKTC處理60min 的方式，不僅有充分效保證凝血因子IX的效價回收率（97. 0 % )，還因滅活時間更長，確保 了耐熱細(xì)小病毒（如PPV)可滅活大于41og以上，生產(chǎn)的產(chǎn)品安全性更高。本發(fā)明所制備 得到的人凝血酶原復(fù)合物具有良好的穩(wěn)定性：2~8°C保存期長達(dá)36個月，按中國藥典全檢 合格。
[0011] 另外，本發(fā)明滅活方法較傳統(tǒng)80°c72小時干熱滅活方法，時間縮短90%以上。
[0012] 本發(fā)明凝血酶原復(fù)合物制劑的病毒滅活エ藝，步驟如下：取凝血酶原復(fù)合物制劑 凍干品，干熱處理，其中，干熱處理的方法是80°C處理2-10h，再在100°C處理30-60min。
[0013] 優(yōu)選地，所述干熱處理的方法是80°C處理4h，再在KKTC處理30~60min。
[0014] 進(jìn)ー步優(yōu)選地，所述干熱處理的方法是80°C處理4h，再在100°C處理60min。
[0015] 本發(fā)明凝血酶原復(fù)合物制劑制備方法，它包括如下步驟：
[0016] (1)取血漿，分離純化得到含凝血酶原復(fù)合物的溶液；
[0017] ⑵在步驟⑴所得溶液中，加入溶液2~4% (w/v)的精氨酸或其鹽類，分裝、凍 干，按照前述方法干熱處理，即可。
[0018] 步驟（1)中，所述分離純化方法為：用凝膠吸附血漿，洗脫，將洗脫液超濾，病毒滅 活，二次凝膠吸附，洗脫，即可。
[0019] 步驟（1)中，所述含凝血酶原復(fù)合物的溶液中，人凝血因子IX的活性不低于IOIU/ ml,人凝血因子II的活性不低于101U/ml、人凝血因子X的活性不低于101U/ml,人凝血因 子VII的活性不低于5IU/ml。
[0020] 步驟⑵中，所述精氨酸或其鹽類的加入量為溶液的2. 4~4% (w/v)，進(jìn)ー步優(yōu) 選地為2. 4~2. 5 %，再進(jìn)ー步優(yōu)選為2. 4 %。
[0021] 所述精氨酸的鹽類為鹽酸精氨酸。
[0022] 本發(fā)明還提供了前述方法制備得到的凝血酶原復(fù)合物制劑。
[0023] 采用本發(fā)明病毒滅活方法，可以有效滅活耐熱細(xì)小病毒，安全性高；同時，本發(fā)明 方法制得的凝血酶原復(fù)合物制劑穩(wěn)定性好，2~8°C36個月全檢合格，第II、W、IX、X凝血 因子無顯著損失，且維持良好比例；本發(fā)明滅活方法較傳統(tǒng)80°C72小時干熱滅活方法，時 間縮短90%以上，生產(chǎn)成本顯著降低。
[0024] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0025] 以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)ー步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說明】
[0026] 圖1是制備本發(fā)明凝血酶復(fù)合物制劑的示意圖。
【具體實施方式】
[0027] 實驗材料：枸櫞酸鈉、氯化鈉、鹽酸精氨酸、