除上皮細胞層； 在手術(shù)顯微鏡下用寶石刀做角膜緣切口，伸入虹膜恢復器分離前層角膜，分離完全后用角 膜剪剪下前層角膜，角膜緣切口深約1/3,厚為0· 2-0. 8mm，長為3mm，分離的板層厚度為 0. 2-0. 8_，或直接用板層角膜分離刀分離深約1/3 (厚約0. 2-0. 8_)的前板層角膜；然后 將分離下前板層角膜放于角膜枕上（前彈力層面朝下），用角膜環(huán)鉆取出3-10mm直徑的板 層角膜；將新鮮板層角膜經(jīng)過血清浸泡，浸泡所用血清為人滅活血清，將板層角膜基質(zhì)片放 于裝有人滅活血清的密閉無菌的5mlEP管或培養(yǎng)皿內(nèi)浸泡，浸泡時間為12-30小時，浸泡 時間優(yōu)選為16-24小時，血清可以為A、B、0、AB的任意一種；然后將浸泡后的板層角膜基 質(zhì)片進行冰浴電泳處理，冰浴電泳所用電泳液為TA電泳液，將整個電泳槽放于密閉消毒盒 內(nèi)進行冰浴電泳，3-5 °C恒溫冰箱內(nèi)進行冰浴電泳，電泳可為單相水平或雙相電泳的一種， 電泳的時間為1.5-2hs，電泳的電壓為為120-150V;其中IXTA溶液配置方法：將4. 84g TrisBase溶于100mL雙蒸水中，滴加 I. 142ml冰醋酸，然后加雙蒸水至IL ;電泳處理完畢的 板層角膜基質(zhì)片進行梯度脫水，即得到未干燥板層組織工程角膜支架，采用環(huán)氧乙烷滅菌 處理，保存?zhèn)溆茫粚⑽锤稍锝悄せ|(zhì)片放于24孔板內(nèi)進行干燥，所用的干燥技術(shù)處理為真 空凍干，真空晾干，干燥無水〇 &(：12真空干燥，自然晾干，吹干，30-60°C溫箱內(nèi)烘干等其中的 一種或一種以上的組合，時間為6-24hs，得到干燥脫細胞板層角膜；將干燥后的樣品進行 鈷60消毒，進行復水處理，所用的復水劑包括林格氏液，平衡液，I X PBS溶液，DMEM培養(yǎng)液， 短、中期角膜保存液的一種或一種以上的組合，得到復水板層角膜基質(zhì)片，即板層組織工程 角膜基質(zhì)支架，保存?zhèn)溆谩?br>[0059] 本發(fā)明通過單純使用物理及生物學方法來進行組織脫細胞，不使用任何有毒化學 試劑，同時完全保留了天然角膜基質(zhì)的膠原結(jié)構(gòu)。利用動物源性的角膜在人血清中引起的 體外急性排斥反應脫細胞方法去除基質(zhì)細胞的核酸及蛋白成分；利用漂洗或單相/雙相電 泳的方法將細胞殘留碎屑和帶電成分去除干凈，達到徹底去除了支架材料的抗原成分的目 的，通過完全電泳出殘留的核酸成分和C〇60消毒的方法去除了支架材料的病原性。
[0060] 為了能達到開發(fā)產(chǎn)品的要求，在脫細胞處理的各個環(huán)節(jié)（如時間、溫度、電壓、如 何保證無菌及電解液、漂洗液的配置等方面）均經(jīng)過詳細周密的設計和反復嚴格的摸索； 通過一系列制作過程的反復改良和優(yōu)化，使本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
[0061] (1)采用本發(fā)明的技術(shù)方案，制作流程簡單可靠，時間短且易于實施；
[0062] (2)板層組織工程角膜支架來源廣泛，成本低，使用方便；
[0063] (3)經(jīng)DAPI染色（圖2)、DNA Gel結(jié)果（圖4)以及經(jīng)過A型血清浸泡和PBS清 洗對比結(jié)果（圖3)顯示，本發(fā)明方法制作的豬板層角膜基質(zhì)片，脫細胞徹底，殘留細胞核隨 血清浸泡時間的增長而逐漸減少，浸泡24小時后無殘留細胞數(shù)，最小的減少了對角膜基質(zhì) ECM的破壞，不留有任何核酸成分及可溶性蛋白，表面由IV型膠原構(gòu)成的前彈力層以及基底 膜得以保留，有利于自體細胞增殖爬行；
[0064] (4)采用本發(fā)明技術(shù)方案制作的板層組織工程角膜支架，不含有對人體有潛在危 害的毒性物質(zhì)，如去污劑等，具有可加工性，便于根據(jù)需要加工成不同屈光度；
[0065] (5)采用本發(fā)明技術(shù)方案制作的板層組織工程角膜支架，具有良好的生物相容性 和極低的免疫原性，移植后不引起免疫排斥反應；通過生物學性質(zhì)檢測（透明度、含水量、 膨脹率、最大拉伸長度）（參見表1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此種材料與人角膜基質(zhì)極其相近，膠原排列 規(guī)則，間隙均勻；
[0066] (6)本發(fā)明方法不僅有利于優(yōu)化動物角膜基質(zhì)脫細胞條件，同時將為組織工程角 膜產(chǎn)業(yè)化提供重要的技術(shù)支持；采用本發(fā)明技術(shù)方案制作的未干燥豬板層組織工程角膜支 架，用于兔角膜中央內(nèi)平鋪術(shù)后2月（參見圖5)，發(fā)現(xiàn)角膜透明，不影響其透明度，未見明顯 的炎癥反應和排斥反應；
[0067] (7)采用本發(fā)明技術(shù)方案制作的未干燥豬板層組織工程角膜支架，用于兔角膜移 植術(shù)后40天（圖6)，發(fā)現(xiàn)角膜逐漸透明，上皮生長完好，未見明顯的炎癥反應和排斥反應；
[0068] (8)本發(fā)明不僅有利于優(yōu)化動物角膜基質(zhì)脫細胞條件，為臨床上使用自家血清去 除動物源性角膜基質(zhì)細胞用于角膜移植治療及組織工程角膜產(chǎn)業(yè)化提供重要的技術(shù)支持。 [0069] 表1是經(jīng)過本發(fā)明方法制作的各種脫細胞豬板層角膜基質(zhì)片與正常豬板層角膜 的生物學特性比較結(jié)果；
[0070] 表 1
[0071]
【主權(quán)項】
1. 一種脫細胞板層角膜基質(zhì)片的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟一，取新鮮動物眼球進行消毒； 步驟二，消毒后用蘸有酒精的濾紙?zhí)幚?，然后擦除去凈上皮細胞層? 步驟三，在手術(shù)顯微鏡下做角膜緣切口，伸入虹膜恢復器分離前層角膜，分離完全后用 角膜剪剪下前層角膜； 步驟四，用角膜環(huán)鉆取出板層角膜； 步驟五，將新鮮板層角膜經(jīng)過血清浸泡，然后將浸泡后的板層角膜基質(zhì)片進行漂洗或 冰浴電泳處理； 步驟六，將漂洗或電泳處理完畢的板層角膜基質(zhì)片進行梯度脫水，即得到未干燥板層 組織工程角膜支架，采用環(huán)氧乙烷滅菌處理，保存?zhèn)溆茫? 步驟七，將未干燥角膜基質(zhì)片放于24孔板內(nèi)進行干燥，得到干燥脫細胞板層角膜； 步驟八，將干燥后的樣品進行鈷60消毒，進行復水處理，得到復水板層角膜基質(zhì)片，即 得所述的板層組織工程角膜基質(zhì)支架，保存?zhèn)溆谩?br>2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脫細胞板層角膜基質(zhì)片的制備方法，其特征在于：在步 驟一中，將新鮮動物眼球采用碘伏浸泡或含抗菌素的PBS浸泡的方式進行消毒，浸泡后采 用PBS沖洗三次，每次沖洗5min。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脫細胞板層角膜基質(zhì)片的制備方法，其特征在于：在步 驟三中，在手術(shù)顯微鏡下用寶石刀做角膜緣切口，伸入虹膜恢復器分離前層角膜，分離完全 后用角膜剪剪下前層角膜，角膜緣切口深約1/3,厚為0. 2-0. 8mm，長為3mm，分離的板層厚 度為 0. 2-0. 8mm。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脫細胞板層角膜基質(zhì)片的制備方法，其特征在于：在步 驟五中，浸泡所用血清為人新鮮血清或人滅活血清，將板層角膜基質(zhì)片放于裝有人新鮮血 清或人滅活血清的密閉無菌培養(yǎng)皿或EP管內(nèi)浸泡，浸泡時間為12-30小時。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種脫細胞板層角膜基質(zhì)片的制備方法，其特征在于：將板 層角膜基質(zhì)片放于裝有人新鮮血清或人滅活血清的密閉無菌培養(yǎng)皿或EP管內(nèi)浸泡的時間 為16-24小時。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脫細胞板層角膜基質(zhì)片的制備方法，其特征在于：在步 驟五中，進行漂洗采用的漂洗液為等滲液，漂洗液選自PBS，林格氏液或生理鹽水，漂洗時間 為0. 5-5小時。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種脫細胞板層角膜基質(zhì)片的制備方法，其特征在于：在步 驟五中，進行漂洗的時間為1-2小時。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脫細胞板層角膜基質(zhì)片的制備方法，其特征在于：在步 驟五中，冰浴電泳所用電泳液為TA電泳液，將整個電泳槽放于密閉消毒盒內(nèi)進行冰浴電 泳，3-5°C恒溫冰箱內(nèi)進行冰浴電泳，電泳的時間為I. 5-2hs，電泳的電壓為為120-150V ;其 中I X TA溶液配置方法：將4. 84g TrisBase溶于100mL雙蒸水中，滴加 I. 142ml冰醋酸， 然后加雙蒸水至1L。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種脫細胞板層角膜基質(zhì)片的制備方法，該方法取新鮮動物眼球進行消毒；消毒后用蘸有酒精的濾紙?zhí)幚?，然后擦除去凈上皮細胞層；在手術(shù)顯微鏡下做角膜緣切口，伸入虹膜恢復器分離前層角膜，分離完全后用角膜剪剪下前層角膜；用角膜環(huán)鉆取出板層角膜；將新鮮板層角膜經(jīng)血清浸泡之后進行漂洗或冰浴電泳處理；處理完畢后進行梯度脫水，即得到未干燥板層組織工程角膜支架，采用環(huán)氧乙烷滅菌處理，保存?zhèn)溆?；將未干燥角膜基質(zhì)片放于24孔板內(nèi)進行干燥，得到干燥脫細胞板層角膜；將干燥后的樣品進行鈷60消毒，復水處理，得到復水板層角膜基質(zhì)片。本發(fā)明得到的角膜基質(zhì)片透明度高、結(jié)構(gòu)破壞少、生物相容性好、性能與新鮮角膜接近、脫細胞徹底。
【IPC分類】A61L27-36, A61L27-50
【公開號】CN104645415
【申請?zhí)枴緾N201410705588
【發(fā)明人】邵毅
【申請人】南昌大學第一附屬醫(yī)院, 邵毅
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2014年11月28日