一種組織工程人角膜基質(zhì)的體外構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于組織工程角膜基質(zhì)構(gòu)建技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種組織工程人角膜基質(zhì)的體外構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]人角膜基質(zhì)層由人角膜基質(zhì)細胞和200-250個膠原纖維板層構(gòu)成，在維持角膜透明和角膜厚度等方面具有不可替代的作用。角膜一旦受到感染、深度熱燒傷、深度化學(xué)灼傷或手術(shù)創(chuàng)傷等，將引起人角膜基質(zhì)細胞發(fā)生不同程度的損傷，進而導(dǎo)致角膜水腫和瘢痕形成而使視力受損，嚴重者將導(dǎo)致角膜不透明，即引發(fā)角膜病盲疾病，常見的有膠原斑、上皮下基質(zhì)混濁和網(wǎng)狀角膜混濁等。目前，人角膜基質(zhì)移植是目前角膜基質(zhì)病盲治愈的唯一途徑，我國約有角膜病盲患者近500萬人，盡管他們可以通過角膜移植來治愈，但由于捐獻角膜的嚴重匱乏致使絕大多數(shù)患者因得不到適宜的供體而無法復(fù)明。自上個世紀以來，角膜組織工程新興學(xué)科的快速發(fā)展，使組織工程人角膜基質(zhì)的體外構(gòu)建成為可能，也是目前解決捐獻角膜數(shù)量嚴重不足的一種新的可行途徑，更為各種角膜基質(zhì)病盲患者通過組織工程人角膜基質(zhì)的臨床移植和治療帶來了新的希望。
[0003]但是在組織工程人角膜基質(zhì)的體外構(gòu)建研宄中，如何獲得足量的人角膜基質(zhì)細胞作為種子細胞、理想的載體支架，以及體外的構(gòu)建方法，是目前組織工程人角膜基質(zhì)體外構(gòu)建的研宄熱點。國內(nèi)外學(xué)者們分別利用癌基因轉(zhuǎn)染的永生化人角膜基質(zhì)細胞(PetersDM 等，1996 ;Doillon CJ 等，2003 ;Reichl S 等，2004 ;Manzer AK 等，2009 ;Yoshiko K 等，2010)、原代培養(yǎng)的人角膜基質(zhì)細胞(Barbaro V等，2009 ;Proulx S等，2010)和繼代培養(yǎng)3-8 代的人角膜基質(zhì)細胞(Crabb RA 等，2005 ;Builles N 等，2007 ;Vrana E 等，2008)作為種子細胞，分別利用膠原蛋白-硫酸軟骨素凝膠(Griffith M等，1999)、膠原蛋白-聚N-異丙基丙稀酰胺共混聚合物(Shimmura S等，2003)、膠原蛋白-糖胺聚糖-殼聚糖泡沫(Builles N等，2007)、聚羥基乙酸未拆解纖維(Liu和Cao，2007)、水凝膠(Mimura T等，2008)、移植用透明人角膜片(Barbaro V等，2009)、多層膠原纖維(Builles N等，2010)、人角膜基質(zhì)細胞分泌的細胞外基質(zhì)(Proulx S等，2010)和脫細胞豬角膜基質(zhì)(Yoeruek E等，2011)等作為載體支架，在體外構(gòu)建出形態(tài)及組織結(jié)構(gòu)與正常角膜基質(zhì)近似的人角膜基質(zhì)組織類似物，為組織工程人角膜基質(zhì)的體外構(gòu)建開辟了道路，但由于接種種子細胞的方法多采用直接接種法，導(dǎo)致細胞因密度過大而出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象，并且該方法退出在體外培養(yǎng)的時間很長，再者，所用種子細胞或者是轉(zhuǎn)染了癌基因的永生化細胞具有潛在致瘤性，或者是來自眼庫角膜的原代培養(yǎng)細胞或僅傳3-8代的繼代培養(yǎng)細胞，即獲得的人角膜基質(zhì)細胞的數(shù)量非常有限，因而大大限制了組織工程人角膜基質(zhì)的規(guī)?；w外構(gòu)建及其臨床應(yīng)用?，F(xiàn)有組織工程人角膜基質(zhì)體外構(gòu)建的研宄報道，仍局限于實驗研宄，根本無法滿足眾多角膜基質(zhì)病盲臨床的大量需求。
[0004]2011年，樊廷俊等成功建立了非轉(zhuǎn)染、無致瘤性的人角膜基質(zhì)細胞系，可為組織工程人角膜基質(zhì)規(guī)?；瘶?gòu)建提供足量的種子細胞來源。2014年，樊廷俊等對切取的新鮮豬角膜片進行低滲溶脹，在反復(fù)凍融破碎細胞后，以DNA-RNA酶處理去除其中的殘留核酸物質(zhì)，然后浸入含質(zhì)量體積百分比10% -20%右旋糖苷溶液和質(zhì)量體積百分比0.1%-0.2%核黃素的角膜專用交聯(lián)劑溶液，先后利用紫外光A照射交聯(lián)、漂洗、風(fēng)干和電離輻照滅菌，成功制備出了透明性好、機械性強、與人角膜種子細胞生物相容性理想的組織工程角膜載體支架(以下簡稱載體支架)一一脫細胞豬角膜基質(zhì)，成功解決了組織工程人角膜基質(zhì)規(guī)?；瘶?gòu)建缺乏大量理想載體支架的問題。因此，盡早建立一種利用人角膜基質(zhì)細胞和載體支架快速的體外構(gòu)建組織工程人角膜基質(zhì)的方法，是組織工程角膜基質(zhì)規(guī)?；a(chǎn)及臨床應(yīng)用造福全世界角膜基質(zhì)病盲的關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是以人角膜基質(zhì)細胞為種子細胞、脫細胞豬角膜基質(zhì)為載體支架，提供一種組織工程人角膜基質(zhì)的體外構(gòu)建方法，以彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0006]本發(fā)明的體外構(gòu)建方法包括:
[0007]用組織工程人角膜基質(zhì)體外構(gòu)建專用培養(yǎng)液A (以下簡稱體外構(gòu)建專用培養(yǎng)液A)將人角膜基質(zhì)細胞制成細胞懸液，再將該細胞懸液注射入用載體支架專用復(fù)水溶液處理后并用角膜環(huán)鉆制成所需大小的圓形載體支架中，放置至24孔培養(yǎng)板孔中，加入體外構(gòu)建專用培養(yǎng)液A后，置于37°C、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中進行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中更換組織工程人角膜基質(zhì)體外構(gòu)建專用培養(yǎng)液B (以下簡稱體外構(gòu)建專用培養(yǎng)液B)繼續(xù)培養(yǎng)，即得到組織結(jié)構(gòu)和功能與正常人角膜基質(zhì)相近的組織工程人角膜基質(zhì)。
[0008]上述人角膜基質(zhì)細胞懸液的制備方法:先取人角膜基質(zhì)細胞，用含15% -20%小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，再用0.25%胰蛋白酶溶液進行消化、離心收集細胞沉淀，最后再用體外構(gòu)建專用培養(yǎng)液A重懸細胞沉淀，即得均質(zhì)的人角膜基質(zhì)細胞懸液。
[0009]上述人角膜基質(zhì)細胞懸液的細胞濃度范圍是5.0X 16-L OX 17個細胞/毫升。
[0010]上述體外培養(yǎng)的方法:用微量注射器吸取上述人角膜基質(zhì)細胞懸液，在每個載體支架上均勻注射4-6針，每針1-2微升，置入24孔培養(yǎng)板孔中，然后加入體外構(gòu)建專用培養(yǎng)液A，置于37°C、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中進行體外培養(yǎng)，每隔24-36小時更換體外構(gòu)建專用培養(yǎng)液B —次，培養(yǎng)72-120小時后，即得組織工程人角膜基質(zhì)。
[0011]上述體外構(gòu)建專用培養(yǎng)液A的配方:含有15%小牛血清和0.3% -0.5%。凝血酸的DMEM/F12培養(yǎng)液。
[0012]上述體外構(gòu)建專用培養(yǎng)液A的配方又添加了 0.2% -0.4%。纖連蛋白。
[0013]上述體外構(gòu)建專用培養(yǎng)液B的配方:含有15%小牛血清和0.3% -0.5%。凝血酸的DMEM/F12培養(yǎng)液。
[0014]上述體外構(gòu)建專用培養(yǎng)液B的配方又添加了 0.1 %。-0.5%ο ε -氨己酸。
[0015]上述載體支架專用復(fù)水溶液的配方:含有I %妥布霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液。
[0016]本發(fā)明中的種子細胞來自非轉(zhuǎn)染的人角膜基質(zhì)細胞系的核型正常且結(jié)構(gòu)功能正常的人角膜基質(zhì)細胞，該細胞生長狀態(tài)良好、無任何致瘤風(fēng)險，可通過連續(xù)傳代為組織工程人角膜基質(zhì)的批量體外構(gòu)建提供出足量的種子細胞；載體支架的制備工藝僅使用物理(低滲、凍融、風(fēng)干)和酶(DNA-RNA酶)處理，未使用任何有毒的化學(xué)試劑和藥品，安全性高、抗原性小，復(fù)水后的載體支架具有透明性好、結(jié)構(gòu)致密完整、機械性強、與人角膜種子細胞生物相容性好、易于種子細胞附著、迀移和生長、生產(chǎn)成本低等特點，滿足了組織工程人角膜基質(zhì)所用大量載體支架的需要。本發(fā)明接種種子細胞采用注射接種法，不僅大大縮短了體外培養(yǎng)的時間，而且較直接接種法能夠更好的保持載體支架結(jié)構(gòu)的完整性。
[0017]本發(fā)明工藝科學(xué)合理，所構(gòu)建出的組織工程人角膜基質(zhì)在形態(tài)結(jié)構(gòu)和透明度上與正常人角膜基質(zhì)相似，并具有正常角膜基質(zhì)的功能，移植到新西蘭兔、比格犬和獼猴眼中可使其角膜持續(xù)保持透明分別150天、820天和750天以上，表明本發(fā)明所構(gòu)建出的組織工程人角膜基質(zhì)可作為捐獻角膜的替代物用于角膜基質(zhì)異常的修復(fù)，因此已可用于批量生產(chǎn)滿足對組織工程人角膜基質(zhì)的高質(zhì)量需求，且組織工程人角膜基質(zhì)體外構(gòu)建的成本低。
【具體實施方式】
[0018]本發(fā)明涉及的各種溶液的配制方法:
[0019]1、體外構(gòu)建專用培養(yǎng)液A的配制:取常規(guī)配制的DMEM/F12培養(yǎng)液80毫升，加入凝血酸30-50毫克，完全溶解后用0.22微米的微孔濾膜過濾除菌，加入15毫升小牛血清，補加上述的DMEM/F12培養(yǎng)液至100毫升，即為體外構(gòu)建專用培養(yǎng)液A ；
[0020]為了提高人角膜基質(zhì)細胞在載體支架中的附著效果，又將上述培養(yǎng)液的配方上添加了 20-40毫克的纖連蛋白；
[0021]2、體外構(gòu)建專用培養(yǎng)液B的配制:取常規(guī)配制的DMEM/F12培養(yǎng)液80毫升，加入凝血酸30-50毫克，完全溶解后用0.22微米的微孔濾膜過濾除菌，加入15毫升小牛血清，補加上述的DMEM/F12培養(yǎng)液至100毫升，即為體外構(gòu)建專用培養(yǎng)液B ；
[0022]為了提高人角膜基質(zhì)細胞在載體支架中的附著和迀移效果，又將上述培養(yǎng)液的配方上添加了 10-50毫克的ε-氨己酸；
[0023]3、載體支架專用復(fù)水溶液的配制:取常規(guī)配制的DMEM/F12培養(yǎng)液80毫升，加入妥布霉素I克，完全溶解后用0.22微米的微孔濾膜過濾除菌，補加上述的DMEM/F12培養(yǎng)液至100毫升，即為載體支架專用復(fù)水溶液。
[0024]本發(fā)明的具體實施步驟:
[0025]1、人角膜基質(zhì)種子細胞的制備:取來自非轉(zhuǎn)染、無致瘤性人角膜基質(zhì)系的核型正常且結(jié)構(gòu)功能正常的人角膜基質(zhì)細胞，用含15% -20%小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液在底面積75平方厘米培養(yǎng)瓶中置37°C進行擴增培養(yǎng)，細胞增殖36-48小時至對數(shù)生長期后，用玻璃滴管吸出培養(yǎng)液，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化1-2分鐘，加入此前吸出的舊培養(yǎng)液終止消化，1000-1500轉(zhuǎn)/分離心10-15分鐘，細胞沉淀用4毫升體外構(gòu)建專用培養(yǎng)液A懸浮均勻制成均質(zhì)的人角膜基質(zhì)細胞懸液；利用CASY細胞計數(shù)儀進行細胞計數(shù)后，用上述體外構(gòu)建專用培養(yǎng)液A調(diào)整細胞濃度至5.0X 16-L OX 17個細胞/毫升；
[0026]2、載體支架的制備:利用載體支架專用復(fù)水溶液對載體支架浸泡1-2小時進行復(fù)水處理后，再用角膜環(huán)鉆將復(fù)水后的載體支架打成所需大小的圓片；
[0027]3、組織工程人角膜基質(zhì)的體外構(gòu)建:用微量注射器吸取上述人角膜基質(zhì)細胞懸液，在每個載體支架上均勻注射4-6針，每針1-2微升；將注射細胞懸液后的載體支架放入24孔培養(yǎng)板中，加入上述體外構(gòu)建專用培養(yǎng)液A至I毫升，置37°C、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24-36小時更換體外構(gòu)建專用培養(yǎng)液B —次，