臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療肺間質(zhì)纖維化的藥物制劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及間充質(zhì)干細(xì)胞的用途，具體是臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)上清在肺間質(zhì) 纖維化治療中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺間質(zhì)纖維化（Pulmonary Fibrosis，PF)是彌漫性肺間質(zhì)纖維化的簡(jiǎn)稱，是由 于多種原因引起肺泡壁炎癥，繼之肺間質(zhì)形成大量纖維結(jié)締組織和肺結(jié)構(gòu)紊亂的一組異 型疾病?；颊卟∏橹兀∷缆矢?，嚴(yán)重危害人類健康。迄今為止，其病因、發(fā)病機(jī)制尚不明 確，臨床尚缺乏任何有效的治療手段。激素雖然對(duì)以炎癥為主的非特異性間質(zhì)性肺炎有一 定效果，但不能減緩肺纖維化和肺功能下降的進(jìn)程，因而對(duì)特發(fā)性肺纖維化（Idiopathic Pulmonary Fibrosis，IPF)的治療效果差。肺移植是其中一項(xiàng)可選擇的治療策略，但受限 于供體的來(lái)源及巨額的醫(yī)療費(fèi)用，對(duì)于許多患者，通常僅僅接受一些經(jīng)驗(yàn)型的治療和對(duì)癥 支持治療。因此，開發(fā)新的有效治療策略顯得尤為迫切。
[0003] 近年，以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞治療引起了人們的極大興趣。其中，間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSCs)作為一群能夠分化成許多不同的細(xì)胞系和發(fā)揮抗增殖、免疫調(diào)節(jié)、抗炎作用的多能 干細(xì)胞，由于其多能性、遷移能力、低免疫原性等特點(diǎn)引起了人們對(duì)其治療潛能的極大關(guān) 注。研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞可到達(dá)損傷局部，抑制炎癥反應(yīng)，并有助于上皮組織的修復(fù)，已 被建議作為IPF治療的一個(gè)潛在方法。事實(shí)上，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有望應(yīng)用于多種疾病的 治療，包括嚴(yán)重的移植物抗宿主病，糖尿病胰島和腎小球修復(fù)，膿毒癥，急性肝功能衰竭，缺 血性急性腎功能衰竭,急性肺損傷,改善缺血損傷后心功能。同時(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞可分化為 許多類型的細(xì)胞，因此可用于脊髓損傷，中風(fēng)后和結(jié)締組織損傷等的組織再生。研究表明， 間充質(zhì)干細(xì)胞可促進(jìn)彈性蛋白酶誘導(dǎo)肺氣腫的組織再生，定位到石棉引起的肺損傷部位， 幫助肺動(dòng)脈高壓大鼠模型的組織重構(gòu)，減輕卵清蛋白介導(dǎo)的小鼠哮喘模型氣道慢性炎癥， 恢復(fù)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷后肺泡和肺液的平衡，調(diào)節(jié)放射性肺損傷相關(guān)的纖維化反 應(yīng)。
[0004] 一些臨床前數(shù)據(jù)表明，間充質(zhì)干細(xì)胞減輕博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化。Lee等 發(fā)現(xiàn)靜脈給予MSCs能夠降低博萊霉素誘導(dǎo)的肺水腫，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，膠原沉積和總死亡 率。同樣，Ortiz等報(bào)告，在小鼠博萊霉素處理后，MSCs募集到肺損傷的部位，導(dǎo)致減少炎 癥，降低纖維化和細(xì)胞外基質(zhì)的膠原沉積，促進(jìn)組織的修復(fù)。透明質(zhì)酸酶的鼻腔給藥則通過(guò) 招募間充質(zhì)干細(xì)胞到損傷肺從而減輕博萊霉素的損傷效果。同樣，胎盤來(lái)源的干細(xì)胞，也可 定位于肺組織，降低博萊霉素導(dǎo)致的相關(guān)組織損傷。臍帶干細(xì)胞也可聚集到博萊霉素所致 的肺損傷部位，抑制促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并減少肺損傷和膠原沉積。雖然確切的作用機(jī) 制尚未完全闡明，但用博萊霉素（BLM)模型的觀察表明，肺損傷通過(guò)可溶性因子如G-CSF和 GM-CSF的產(chǎn)生而募集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并通過(guò)SDF-1/CXCR4軸介導(dǎo)其增殖和遷移。同樣， IPF患者M(jìn)SC高表達(dá)CXCR4, IPF患者肺組織中CXCR4和SDF-I也比對(duì)照組患者的肺組織更 高。盡管如此，也有一些采用博萊霉素肺損傷模型的研究并沒有取得陽(yáng)性結(jié)果。Aguilar 等利用造血干細(xì)胞（HSCs)和間充質(zhì)干細(xì)胞作為載體，將角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子（KGF)帶入BLM 小鼠的肺臟，結(jié)果僅有轉(zhuǎn)導(dǎo)的造血干細(xì)胞能減輕肺組織損傷，而MSC并沒有改變博萊霉素 損傷的組織病理學(xué)變化，盡管減少了膠原I a ImRNA的表達(dá)。這項(xiàng)研究還表明，KGF轉(zhuǎn)基因 HSCs減輕了 BLM誘導(dǎo)的肺損傷，同時(shí)導(dǎo)致肺泡II型上皮細(xì)胞增殖。因此，深入理解MSC的 生物學(xué)特性，認(rèn)識(shí)疾病特定的免疫微環(huán)境對(duì)MSC療效的影響，進(jìn)而有效提高M(jìn)SC的治療效果 是治療PF的關(guān)鍵。
[0005] 因此，本領(lǐng)域仍需要深入研究MSC的增殖、分化、調(diào)節(jié)等生物學(xué)特性，進(jìn)而利用這 些特性，更好的發(fā)揮其特定疾病中的治療價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的新用途，即它在制備治療肺間質(zhì)纖維化 的藥物制劑中的應(yīng)用。
[0007] 進(jìn)一步地，所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)上清由以下方法制備：將臍帶間充質(zhì)干 細(xì)胞種植于多孔板，加入無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，收集培養(yǎng)上清。
[0008] 進(jìn)一步地，所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)IFN- Y預(yù)處理。
[0009] 進(jìn)一步地，所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)上清由以下方法制備：將臍帶間充質(zhì)干 細(xì)胞種植于多孔板，加入重組IFN-γ作用24小時(shí)，PBS清洗3次，加入無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng) 48h，收集培養(yǎng)上清。
[0010] 進(jìn)一步地，所述藥物制劑是氣管內(nèi)給藥噴霧劑。
[0011] 進(jìn)一步地，所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞由以下方法制備而得：從臍帶中分離提取間充 質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)過(guò)原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)后得到。
[0012] 進(jìn)一步地，所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞由以下方法制備而得：取胎兒娩出后結(jié)扎的臍 帶，經(jīng)沖洗、消毒，置于臍帶保存液中，2~8°C恒溫保存，用無(wú)菌組織剪將華通氏膠體剪切 成1~4mm 3的組織勻楽塊，加入適量培養(yǎng)基，放置于二氧化碳恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第14~ 18天，細(xì)胞克隆團(tuán)的面積百分比到達(dá)70~80%時(shí)，消化收獲，得到PO代細(xì)胞，之后進(jìn)行消 化、傳代，將需凍存的細(xì)胞放置于程序性降溫儀中，按照標(biāo)準(zhǔn)凍存程序降至_80°C以下。
[0013] 進(jìn)一步地，所述間充質(zhì)干細(xì)胞的⑶90、⑶29、⑶73、⑶105、⑶44、⑶166表達(dá)均大于 95%，CD45、CD14、HLA-DR 表達(dá)均小于 2%。
[0014] 一種治療肺間質(zhì)纖維化的藥物組合物，其包含前述的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)上 清。
[0015] 本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明：用IFN-Y預(yù)處理臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表型能引起IP-10、 PGE2的mRNA表達(dá)水平升高，用IFN-γ預(yù)處理臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞能引起培養(yǎng)上清中IP-10、 PGE2的表達(dá)水平明顯升高。
[0016] 本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明：MSC所高分泌的IP-10具有對(duì)抗肺纖維化過(guò)程中成纖維細(xì) 胞的聚集作用，而PGE2可明顯抑制IPF患者成纖維細(xì)胞的活化。
[0017] 由于博來(lái)霉素（BLM)會(huì)傷害肺部造成肺纖維化或嚴(yán)重的間質(zhì)性肺病，已經(jīng)成為當(dāng) 今經(jīng)典的動(dòng)物肺纖維化模型的誘導(dǎo)劑。選用BLM作為誘導(dǎo)劑，經(jīng)氣管內(nèi)給藥誘導(dǎo)小鼠肺纖 維化，分析小鼠成活率和肺組織病理學(xué)評(píng)分，動(dòng)態(tài)觀察小鼠肺組織形態(tài)學(xué)變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表 明，采用IFN-Y預(yù)處理的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)上清治療肺纖維化的小鼠，可明顯提高 小鼠成活率，減輕BLM誘導(dǎo)的肺纖維化肺部病變，明顯降低小鼠肺組織病理學(xué)評(píng)分。
[0018] 本發(fā)明的有益效果是：
[0019] 1本發(fā)明通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)證明了 IFN-Y預(yù)