抗腫瘤多肽和透明質(zhì)酸酶藥物組合物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用基因調(diào)控制備抗腫瘤多肽和透明質(zhì)酸酶組合物及其制備 方法，屬于基因工程領(lǐng)域。具體涉及抗腫瘤多肽LRR5組成型表達載體及人透明質(zhì)酸酶 rhPH-20誘導(dǎo)型表達載體的構(gòu)建，包含抗腫瘤多肽及人透明質(zhì)酸酶的重組畢赤酵母的構(gòu)建； 還涉及重組酵母發(fā)酵生產(chǎn)抗腫瘤多肽與透明質(zhì)酸酶組合物過程中，通過誘導(dǎo)劑甲醇添加時 間調(diào)控抗腫瘤多肽與透明質(zhì)酸酶表達量比例的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前對腫瘤患者常見的化療和放療手段往往導(dǎo)致嚴重的副作用，因此尋找高效、 低毒的抗腫瘤藥物是目前的重要研究方向。在實體腫瘤組織中，新生血管是維持腫瘤細胞 新陳代謝的重要保障，是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移不可缺少的條件之一。腫瘤新生血管生成過程依 賴于血管內(nèi)皮細胞（VEC)增殖、移行、黏附和侵入細胞外基質(zhì)（ECM)等幾個階段。由于內(nèi)皮 細胞較其它細胞更易接觸到血管內(nèi)的藥物，且具有遺傳穩(wěn)定性和不易突變?yōu)槟退幍耐蛔凅w 等特點，抑制內(nèi)皮細胞生長、增殖和轉(zhuǎn)移的多肽類藥物成為最有效的抗腫瘤藥物之一。來 自于蛋白聚糖結(jié)構(gòu)中的一段富亮氨酸重復(fù)序列5 (LRR5)被證實是一種抗腫瘤多肽，屬于血 管新生抑制因子。它可以抑制由血管內(nèi)皮生長因子（VEGF)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞遷移、在基質(zhì)膠 上的血管生成及與胞外基質(zhì)中纖維連接蛋白的接觸，還可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡，最終達到 抗腫瘤的目的。LRR5序列中的不同部分具有不同的抗腫瘤機制，中間區(qū)域的12個氨基酸 (LRR5M)抑制內(nèi)皮細胞血管生成的作用是LRR5的上千倍；碳端的氨基酸（LRR5C)能有效抑 制VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞遷移；而氮端的氨基酸序列（LRR5N)主要用于阻止內(nèi)皮細胞與纖維 蛋白接觸。另外，LRR5M和LRR5N均具有誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡的作用。
[0003] 透明質(zhì)酸（hyaluronic acid, HA)是由（1-3)-2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-葡萄 糖-(1-4)-0-β -D-葡糖醛酸雙糖重復(fù)單位組成的直鏈非硫酸化多聚糖，是細胞外基質(zhì)的 重要組成部分。眾多研究表明，在腫瘤浸潤區(qū)及轉(zhuǎn)移過程中，通常會伴隨HA水平顯著升高。 例如在結(jié)腸癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌、靜脈平滑肌瘤及淋巴瘤中，HA的水平均有所升高，并且 在結(jié)腸癌的惡性病變過程中伴隨著HA表達量的增加。腫瘤發(fā)生時，HA可以通過多種方式 促進腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移，它的大量存在使得抗腫瘤藥物難于接近細胞，不利于腫瘤的治療。 透明質(zhì)酸酶（hyaluronidase，HAase)是能使HA產(chǎn)生低分子化作用酶的總稱，又被稱為玻璃 酸酶。在臨床治療中，透明質(zhì)酸酶通過對HA的解聚作用，能加速物質(zhì)的擴散和吸收，提高局 麻效果，并且能防止皮下及肌肉注射后組織的破壞。美國FDA已批準其單劑量小包裝注射 用綿羊透明質(zhì)酸酶（Vitrase)無菌液作為分散劑，可用于促進其它藥物分散和吸收。
[0004] 因此，在腫瘤的治療過程中，將抗腫瘤多肽與透明質(zhì)酸酶合用，可通過后者對細胞 外基質(zhì)的降解，使藥物易于接近腫瘤并被其攝取，從而提高腫瘤對藥物的敏感性。另外，由 于在蛋白質(zhì)表達方面，畢赤酵母（Pichia pastoris)具有大腸桿菌、釀酒酵母菌表達系統(tǒng)所 不可比擬的優(yōu)點，采用重組畢赤酵母制備抗腫瘤多肽與透明質(zhì)酸酶的組合物，可實現(xiàn)抗腫 瘤藥物的大規(guī)模生產(chǎn)，簡化產(chǎn)物的制備和純化工藝，降低藥物生產(chǎn)成本。同時，在重組酵母 發(fā)酵過程中采用基因調(diào)控手段控制組合物中透明質(zhì)酸酶的表達量，有利于提高抗腫瘤藥物 的有效性和安全性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的之一在于為了克服抗腫瘤多肽藥物在腫瘤部位的難吸收問題，而提 供一種抗腫瘤多肽與透明質(zhì)酸酶組合的產(chǎn)品。
[0006] 本發(fā)明的目的之二在于為了克服抗腫瘤多肽與透明質(zhì)酸酶提取與制備的低純度、 高成本問題，而提供一種能制備抗腫瘤多肽與透明質(zhì)酸酶的組合物的畢赤酵母基因工程菌 株。
[0007] 本發(fā)明的目的之三在于為了避免組合物中透明質(zhì)酸酶過量引起的潛在副作用問 題，而提供一種利用誘導(dǎo)物添加時間來控制組合物中透明質(zhì)酸酶表達量的基因調(diào)控方法。
[0008] 本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案達到的：首先構(gòu)建一種用于表達抗腫瘤多 肽的組成型表達載體及一種用于表達透明質(zhì)酸酶的誘導(dǎo)型表達載體；然后將兩個載體依次 導(dǎo)入宿主體內(nèi)得到一種用于制備抗腫瘤多肽和透明質(zhì)酸酶組合物的基因工程菌株；在重組 菌株發(fā)酵過程中抗腫瘤多肽為組成型表達，而透明質(zhì)酸酶的表達量由誘導(dǎo)劑的添加時間控 制。
[0009] 本發(fā)明將序列1所示抗腫瘤多肽LRR5的氨基酸序列按照畢赤酵母密碼子偏愛性 獲得序列2,然后與組成型表達載體pGAPZaA進行可操作性連接，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒，命名 為pGAPZaA-lrr5。并采用電穿孔方法將表達載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115菌株，利用抗生素篩 選得到包含LRR5核苷酸序列的重組畢赤酵母。
[0010] 本發(fā)明將人透明質(zhì)酸酶rhPH-20去除自身信號肽及GPI錨定區(qū)后得到序列3所示 的氨基酸序列，按照畢赤酵母密碼子偏愛性獲得序列4,然后與誘導(dǎo)型表達載體pPIC9進行 可操作性連接，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒，命名為pPIC9-rhPH-20 ;并采用電穿孔方法將表達載體 轉(zhuǎn)化包含LRR5核苷酸序列的重組畢赤酵母GSl 15,利用營養(yǎng)缺陷型篩選得到同時包含LRR5 和rhPH-20核苷酸序列的重組畢赤酵母菌株。
[0011] 所得重組畢赤酵母菌株命名為畢 lrr5-pPIC9-rhPH90,已于2013年10月17日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編 100101)保藏，分類命名為畢赤酵母（Pichia pastoris)，保藏號CGMCC No. 8350。
[0012] 本發(fā)明在重組酵母的發(fā)酵過程中，LRR5的表達在GAP啟動子控制下組成型表達， rhPH-20的表達在AOXI啟動子控制下的表達嚴格受甲醇誘導(dǎo)。
[0013] 本發(fā)明提供了一種在發(fā)酵過程中根據(jù)誘導(dǎo)劑甲醇的誘導(dǎo)時間控制透明質(zhì)酸酶表 達量的基因調(diào)控方法。包括：將重組酵母菌株接種培養(yǎng)，然后按照5%~10%接種量接種于含 3%~5%葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基中；通氣攪拌培養(yǎng)，在整個培養(yǎng)過程中氧氣飽和度不低于20% ; 14~24h后，加入甲醇，使甲醇的終濃度維持在0. 1%~1%，繼續(xù)培養(yǎng)24~48h ;停止加入甲 醇，繼續(xù)培養(yǎng)5~8h。按照2~8mV (h噸）的流動量加入30%~50%甘油，繼續(xù)培養(yǎng)48~ 72h。
[0014] 本發(fā)明利用畢赤酵母表達系統(tǒng)制備抗腫瘤多肽與透明質(zhì)酸酶的組合物，與直接從 組織提取多肽類藥物的傳統(tǒng)方法相比，具有可大規(guī)模生產(chǎn)，產(chǎn)物的制備和純化工藝簡單，藥 物生產(chǎn)成本降低等優(yōu)點；并在重組酵母發(fā)酵過程中采用基因調(diào)控手段控制組合物中透明質(zhì) 酸酶的表達量，有利于提高抗腫瘤藥物的有效性和安全性；另外，在惡性腫瘤治療過程中， 將抗腫瘤多肽與透明質(zhì)酸酶合用可充分發(fā)揮后者對細胞外基質(zhì)的降解作用，與單純使用抗 腫瘤藥物相比，具有能使藥物更易于接近腫瘤并被其攝取，提高腫瘤對藥物的敏感性的潛 在意義。
【附圖說明】
[0015] 圖1實施例1抗腫瘤多肽LRR5核苷酸序列與組成型表達載體pGAPZaA重組質(zhì)粒 構(gòu)建圖
[0016] 圖2實施例1人透明質(zhì)酸酶rhPH-20核苷酸序列與誘導(dǎo)型表達載體pPIC9重組質(zhì) 粒構(gòu)建圖
[0017] 圖3實施例1甲醇誘導(dǎo)不同時間的菌體生長曲線
[0018] 圖4實施例1不同甲醇誘導(dǎo)時間的抗腫瘤多肽與透明質(zhì)酸酶的蛋白量
[0019] Ianel :甲醇誘導(dǎo) 24h ;lane2 :甲醇誘導(dǎo) 48h ;lane3 :甲醇誘導(dǎo) 72h ;M :protein marker
【具體實施方式】
[0020] 實施例1包含抗腫瘤多肽LRR5及人透明質(zhì)酸酶rhPH-20核苷酸序列的重組酵母 的構(gòu)建
[0021] 菌株與載體大腸桿菌Escherichia, coli ToplO購自北京博尚展新生物技術(shù)公司， 畢赤酵母 GSl 15 (His-Mut+)、質(zhì)粒 pGAPZaA、質(zhì)粒 pPIC9 均購自 Invitrogen 公司。
[0022] 酶與試劑盒限制性內(nèi)切酶、連接酶購自Takara公司，Taq酶Mix、PFU酶Mix購自 百泰克公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自TIANGEN公司，凝膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司。
[0023] 生化試劑DNA全序列合成、引物合成及DNA序列測序在北京博尚展新生物技術(shù)公 司完成，各化學試劑除特別說明外均為國產(chǎn)分析純。
[0024] 培養(yǎng)基大腸桿菌培養(yǎng)基為LB (1%胰蛋白胨、0· 5%酵母提取物、l%NaCl，ρΗ7· 0)和 低鹽LB (1%胰蛋白胨、0. 5%酵母提取物、0. 5%NaCl，pH7. 5)。酵母完全培養(yǎng)基為YH) (1%酵 母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖)。酵母篩選培養(yǎng)基為MD( I. 34%YNB、0. 00004%Biotin、2%葡 萄糖)。重組酵母發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基[2. 67%磷酸（v/v)、0. 093%CaS04、l. 82%K2S04、 I. 49%MgS04 · 7Η20、0· 413%K0H 和 4% 甘油]和微量鹽溶液 PTM1 (0· 6%CuS04、0. 008%NaI、 0· 3%MgS04 · Η20、0· 02%Na2Mo04 · 2Η20、0· 002% 硼酸、0· 05%CoCl2、2%ZnCl2、6. 5%Fe2S04 · 7H20、 0. 02%Biotin和0. 5%硫酸（v/v)。重組酵母搖瓶基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基[0. 5%(NH4)2S04， 0· 0465%CaS04,0. 9%K2S04,0 . 745%MgS04 · 7H20, L 2%ΡΤΜ1 (v/v)，0· 68%ΚΗ2Ρ04