miR-216在制備促進成骨分化的藥物中的用圖
【技術(shù)領域】
[0001] 本領域涉及再生醫(yī)學領域，具體而言涉及miRNA在制備促進成骨分化的藥物中的 用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 人間充質(zhì)干細胞（hMSCs)具有自我更新和多譜系分化潛能，在適當條件下能夠分 化為骨、軟骨、脂肪和肌組織（Prockop，DJ，1997 ;Phinney，DG，2007 ;PUtenger，MF 等人， 1999和Fink，T等人，2011)。研究者首先從骨髓中分離出MSC (BMSCs),并證明了其多系分 化的能力。BMSCs向成骨細胞分化是機體普遍存在的生理過程。在生理條件下，骨組織呈 現(xiàn)成骨細胞的骨形成和破骨細胞的骨吸收的動態(tài)平衡。一旦各種原因?qū)е逻@種動態(tài)平衡破 壞，如成骨分化能力降低時，就會引起骨質(zhì)疏松、鎖骨顱骨發(fā)育不全、股骨頭壞死、關節(jié)退行 性變、脊柱側(cè)彎等骨相關疾病。因此，揭示間充質(zhì)干細胞成骨的調(diào)控機制具有極其重要的臨 床應用價值。
[0003] 由于受來源的限制以及取樣困難，BMSC的研究和應用發(fā)展較慢。后來的研究發(fā)現(xiàn)， 除骨髓外，MSC還廣泛存在于脂肪、皮膚、滑液、脫落的牙齒、羊水和胎盤等多種組織器官中 (Prockop，DJ，1997)。研究證明，與骨髓來源的MSC相似，人脂肪組織來源的MSC (hAMSCs) 具有跨系甚至跨胚層的多向分化潛能，在體內(nèi)外可分化成多種細胞類型，如成骨細胞、軟骨 細胞、脂肪細胞、肌細胞、內(nèi)皮細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞等。此外與BMSC相比，hAMSC s具有原料充 足，取材方便，體外分離擴增方法簡單易行等優(yōu)點，因此備受研究者青睞。目前MMSCs已經(jīng) 成為研究MSC自我更新和分化的最佳細胞模型和最有發(fā)展?jié)摿Φ慕M織工程種子細胞。
[0004] MicroRNAs UiRNAs)是一類高度保守的非編碼小RNA分子，能夠在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄 后水平調(diào)控靶基因表達（Ambros，V，2004 ;Bartel，DP，2004)。最近，越來越多的證據(jù)表明 miRNAs能夠調(diào)控細胞分化和命運決定（Ivey, KN and D Srivastava，2010)。目前，miR-125、 miR-133、miR-135、miR-138、miR-181、miR-206、miR-9、miR-27、miR_196a、miR-214、 miR-764-5p、miR-2861、miR-3960、miR-642a-3p、miR-141/200a 和 miR-17-5p ~92/ miR-106a等許多miRNAs已經(jīng)被證實參與成骨分化的調(diào)控。miR-214轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出明 顯的成骨能力降低（Wang，X，2013)。這些研究結(jié)果提示，HiiRNA s在MSC的成骨分化調(diào)控中 可能扮演了非常重要的角色。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 根據(jù)一些【具體實施方式】，本發(fā)明提供miR-216在制備促進成骨分化的藥物中的用 途。
[0006] 在一些【具體實施方式】中，miR-216促進人脂肪組織來源的間充質(zhì)干細胞向成骨分 化。
[0007] 在一些【具體實施方式】中，miR-216的序列如SEQ ID No. 1所示。SEQ ID No. 1為 UAAUCUCAGCUGGCAACUGUGA，其登錄號為 miRbase Accession number MIMAT0000273。
[0008] 在一些【具體實施方式】中，通過轉(zhuǎn)染試劑提供miR-216 ;轉(zhuǎn)染試劑優(yōu)選為脂質(zhì)體。在 一些【具體實施方式】中，轉(zhuǎn)染試劑是Lipofectamine2000。
[0009] 在一些【具體實施方式】中，miR-216的轉(zhuǎn)染濃度為100nmol/L。
【附圖說明】
[0010] 圖I :hAMSCs經(jīng)成骨誘導培養(yǎng)基誘導后3天的ALP染色。
[0011] 圖2 :hAMSCs經(jīng)成骨誘導培養(yǎng)基誘導后12天的茜素紅染色。
[0012] 圖3A :轉(zhuǎn)染NC對照后，hAMSCs的ALP染色。
[0013] 圖 3B :轉(zhuǎn)染 miR-216a 后，hAMSCs 的 ALP 染色。
[0014] 圖4A :轉(zhuǎn)染NC對照后，hAMSCs的茜素紅染色。
[0015] 圖4B :轉(zhuǎn)染miR-216a后，hAMSCs的茜素紅染色。
[0016] 圖5 :成骨誘導后堿性磷酸酶的活性。hAMSCs :未經(jīng)轉(zhuǎn)染的hAMSCs ;NC :轉(zhuǎn)染有NC 對照的、經(jīng)過成骨誘導的hAMSCs ;miR-216a :轉(zhuǎn)染有miR-216a的、經(jīng)過成骨誘導的hAMSCs。
【具體實施方式】
[0017] 以下提供了本發(fā)明實施方式中所使用的具體材料及其來源。但是，應當理解的是， 這些僅僅是示例性的，并不意圖限制本發(fā)明，與如下組織、細胞、試劑和儀器的類型、型號、 品質(zhì)、性質(zhì)或功能相同或相似的材料均可以用于實施本發(fā)明。
[0018] 實施例1 :成人脂肪源間充質(zhì)干細胞的分離和鑒定
[0019] 1.成人脂肪組織取自吸脂手術(shù)患者（中國醫(yī)學科學院整形醫(yī)院)，與自愿捐獻者簽 訂知情同意書，捐獻者均為25-35歲的健康女性。
[0020] 2.從脂肪組織中分離hAMSCs的方法簡述如下：
[0021] 吸脂術(shù)采集出來的脂肪組織用D-Hanks洗去血細胞和麻醉藥，0. 2g/100mlII型膠 原酶(購自：美國Life Technologies公司）消化Ih,之后用D-Hanks洗漆2遍以除去膠原 酶。
[0022] 離心收集細胞，細胞以2X106/ml的密度接種于含58% (v/v)DMEM/F12+40% (v/ v)MCDB-201、2% (v/v)胎牛血清、10ng/ml EGF、10ng/ml PDGF、1X 胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞 硒酸（ITS)UX亞油酸-牛血清白蛋白、50μΜ beta-巰基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、100μ g/ ml青霉素和lOOU/ml硫酸鏈霉素的干細胞培養(yǎng)液，37°C、5%C02、95%濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0023] 兩天后換液，棄去未貼壁的細胞，以后每3天半量換液。
[0024] 當細胞達70%~80%匯合時，0· 25g/100ml胰酶（Gibco)常規(guī)消化，細胞按照1 :3 進行傳代。
[0025] 3. hAMSCs 的表型：
[0026] 收集第三代細胞，PBS洗3次；
[0027] 加 0. 1%皂素室溫破膜1小時，PBA洗3次(若檢測細胞內(nèi)抗原，則進行本步驟；若 檢測細胞表面抗原，則直接進行下一步）；
[0028] 加一抗（CD29、CD44、CD105、CD31、CD34、CD106、HLA-DR、FLK-I 單抗，購自：BD 公 司），4°C孵育30分鐘；
[0029] 加 PBS洗3次，加 FITC標記二抗(兔抗鼠，購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司），4°C 孵育30分鐘；
[0030] 加 PBS洗3次，4%多聚甲醛固定，300ul PBS重懸；
[0031] 上流式細胞儀（品牌、型號）檢測細胞。經(jīng)鑒定，細胞呈現(xiàn)典型的AMSC表型：
[0032] CD29+、CD44+、CD105+、FLK-Γ ;
[0033] CD31' CD34' CD106' HLA-、DR'
[0034] 實施例2 :miRNAs的轉(zhuǎn)染
[0035] 1.試劑：
[0036] (1)轉(zhuǎn)染試劑為 Lipofectamine2000 (Invitrogen);
[0037] (2)待轉(zhuǎn)染的 HiiRNAs :
[0038] miR-216 粉末為美國 Life Technologies 公司合成；
[0039] 采用公知技術(shù)合成與miR-216長度相似的無關序列（SEQ ID No. 2 : UUCUUCGAACGUGUCACGUTT)作為 NC 對照。
[0040] 2.待轉(zhuǎn)染的HIiRNAs儲備液配置：
[0041] 將裝有待轉(zhuǎn)染的HiiRNAs的管低速離心5min，按照Lipofectamine2000 (Invitrogen)說明書加入Opti-MEM溶解miRNA s，震蕩并瞬時離心配成20 μ M的儲備液。
[0042] 3.細胞準備：
[0043] 取第3代對數(shù)生長期、70%_80%匯合的hAMSCs進行轉(zhuǎn)染。
[0044] 4.轉(zhuǎn)染過程：
[0045] 用Opti-MEM分別稀釋待轉(zhuǎn)染的HiiRNAs和Lipofectamine2000,輕輕混勻后室溫放 置 5min ;
[0046] 將Lipofectamine2000稀釋液緩慢逐滴加入待轉(zhuǎn)染的miRNAs稀釋液中，輕輕混勻 獲得miRNA s和Lipofectamine2000混合液，室溫孵育20min ;
[0047] 從培養(yǎng)箱取出待轉(zhuǎn)染細胞，吸出培養(yǎng)液，用DPBS液(杜氏磷酸緩沖液)洗3遍，吸凈 洗液后每孔加入I. 5ml Opti-MEM ;
[0048] 將孵育好的miRNAs-Lipofectamine2000混合液緩慢逐滴入培養(yǎng)皿中.轉(zhuǎn)染量： HiiRNAs