游的正確讀碼框中，提供起始密碼子ATG。
[0126] 可以以分離的和/或純化的形式（例如，不含或基本上不含編碼具有所需功能的 多肽的多核苷酸以外的來源的多核苷酸）提供多核苷酸和載體。本文使用的"基本上純的" 和"基本上不含"表示，含有少于例如約20%或更少外來物、約10%或更少外來物、約5%或 更少外來物、約4%或更少外來物、約3%或更少外來物、約2%或更少外來物或約1%或更少 外來物的溶液或懸浮液。
[0127] 多種宿主/表達載體組合可以用于表達本發(fā)明的DNA序列。有用的表達載體，例 如，可以由染色體的、非染色體的和合成的DNA序列的區(qū)段組成。合適的載體包括、但不限 于：SV40和已知的細菌質(zhì)粒的衍生物，例如，大腸桿菌質(zhì)粒col El、Pcrl、Pbr322、Pmb9和它 們的衍生物，質(zhì)粒諸如RP4 ;噬菌體DNA，例如，噬菌體λ的眾多衍生物，例如，NM989和其他 噬菌體DNA，例如，Μ13和絲狀單鏈噬菌體DNA ;酵母質(zhì)粒諸如2u質(zhì)?；蚱溲苌?；可用于真 核細胞中的載體，諸如可用于昆蟲或哺乳動物細胞中的載體；源自質(zhì)粒和噬菌體DNA的組 合的載體，諸如已經(jīng)被修飾成采用噬菌體DNA或其他表達控制序列的質(zhì)粒；等。
[0128] 本文也提供了一種重組宿主細胞，其包含一種或多種多核苷酸構(gòu)建體。編碼本文 提供的抗體的多核苷酸形成本申請的一個方面，抗體的生產(chǎn)方法也形成本申請的一個方 面，所述方法包括：從一種或多種多核苷酸進行表達。例如，通過在適當條件下培養(yǎng)含有所 述多核苷酸的重組宿主細胞，可以實現(xiàn)表達。然后使用任何合適的技術(shù)，可以分離和/或純 化抗體，并適當?shù)厥褂谩?br>[0129] 多種表達控制序列（控制可操作地連接到它上的DNA序列的表達的序列）中的任 一種可以用于這些載體中，以表達DNA序列。這樣的有用的表達控制序列包括，例如，SV40 的早期或晚期啟動子、CMV、牛痘、多瘤或腺病毒、he系統(tǒng)、ir/7系統(tǒng)、TAC系統(tǒng)、TRC系統(tǒng)、 LTR系統(tǒng)、噬菌體λ的主要操縱子和啟動子區(qū)、fd外殼蛋白的控制區(qū)、3-磷酸甘油酸酯激 酶或其他糖酵解酶的啟動子、酸性磷酸酶的啟動子（例如，Ph 〇5)、酵母α交配因子的啟動 子和已知控制原核或真核細胞的基因或它們的病毒的表達的其他序列和它們的不同組合。
[0130] 應(yīng)當理解，并非所有載體、表達控制序列和宿主同樣好地起表達DNA序列的功能。 也并非所有宿主對相同的表達系統(tǒng)同樣好地起作用。但是，無需過多實驗，本領(lǐng)域技術(shù)人員 能夠選擇適當?shù)妮d體、表達控制序列和宿主，以實現(xiàn)期望的表達，而不脫離本申請的范圍。 例如，在選擇載體時，必須考慮宿主，因為所述載體必須在所述宿主中發(fā)揮功能。還會考慮 載體的拷貝數(shù)、控制該拷貝數(shù)的能力以及由所述載體編碼的任何其他蛋白（諸如抗生素標 志物）的表達。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以選擇適當?shù)妮d體、表達控制序列和宿主，以實現(xiàn)期 望的表達，而不脫離本申請的范圍。例如，在選擇載體時，考慮宿主，因為所述載體必須在所 述宿主中發(fā)揮功能。還可以考慮載體的拷貝數(shù)、控制該拷貝數(shù)的能力以及由所述載體編碼 的任何其他蛋白（諸如抗生素標志物）的表達。
[0131] 本申請也提供了在本文別處所述的質(zhì)粒、載體、轉(zhuǎn)錄或表達盒形式的構(gòu)建體，它 們包括至少一個上述的多核苷酸。可以選擇或構(gòu)建合適的載體，其含有適當?shù)恼{(diào)節(jié)序列， 包括啟動子序列、終止子序列、聚腺苷酸化序列、增強子序列、選擇標記和適當?shù)钠渌?列。載體可以是適當?shù)馁|(zhì)粒、病毒，例如適當?shù)氖删w、噬粒等。關(guān)于其他細節(jié)，參見，例 如，Molecular Cloning: a Laboratory Manual:第 2 版，Sambrook 等人，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press。許多已知的核酸操作技術(shù)和方案，例如核酸構(gòu)建體 的制備、誘變、測序、將DNA導入細胞中和基因表達以及蛋白的分析，詳細描述在：Short Protocols in Molecular Biology,第 2 版，Ausubel 等人編，John Wiley & Sons, 1992。Sambrook等人和Ausubel等人的方法和公開內(nèi)容以其整體通過引用并入本文。
[0132] 在選擇表達控制序列時，通?？紤]多種因素。這些因素包括，例如，系統(tǒng)的相對強 度、它的可控性和它與要表達的特定DNA序列或基因的相容性，特別是在潛在二級結(jié)構(gòu)方 面。通過考慮例如它們與選擇的載體的相容性、它們的分泌特征、它們的正確折疊蛋白的能 力、和它們的發(fā)酵需要以及由要表達的DNA序列編碼的產(chǎn)物對宿主的毒性和表達產(chǎn)物的純 化容易性，選擇合適的單細胞宿主。
[0133] 另一個方面提供了一種宿主細胞，其含有一種或多種本文公開的多核苷酸。另一 個方面提供了通過任何可利用的技術(shù)將這樣的一種或多種多核苷酸導入宿主細胞中的方 法。對于真核細胞，合適的技術(shù)可以包括，例如，磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE葡聚糖、電穿孔、脂質(zhì)體介 導的轉(zhuǎn)染和使用逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他病毒（例如，牛痘），或者對于昆蟲細胞，桿狀病毒的轉(zhuǎn) 導。對于細菌細胞，合適的技術(shù)可以包括，例如，氯化鈣轉(zhuǎn)化、電穿孔和使用噬菌體的轉(zhuǎn)染。
[0134] 在導入之后，可以造成或允許一種或多種多核苷酸的表達，例如通過在從一種或 多種多核苷酸表達一種或多種多肽的條件下培養(yǎng)宿主細胞?？梢允褂每烧T導的系統(tǒng)，并通 過加入活化劑來誘導表達。
[0135] 在一個實施方案中，可以將多核苷酸整合進宿主細胞的基因組（例如染色體）中。 根據(jù)標準技術(shù)，通過包含促進與基因組的重組的序列，可以促進整合。在另一個實施方案 中，所述核酸維持在宿主細胞中的附加型載體上。
[0136] 本文提供了這樣的方法，所述方法包括：在表達系統(tǒng)中使用上述的構(gòu)建體，以便表 達特定多肽。
[0137] 考慮到這些和其他因素，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠構(gòu)建多種載體/表達控制序列/宿 主組合，它們在發(fā)酵或大規(guī)模動物培養(yǎng)中表達所述DNA序列。
[0138] 除了克隆以外，或作為克隆的替代，可以重組地/合成地制備編碼抗體或其部分 的多核苷酸?？梢詫⒍嗪塑账嵩O(shè)計成具有適當?shù)拿艽a子。一般而言，如果序列要用于表 達，將選擇對于目標宿主而言優(yōu)選的密碼子?？梢詮耐ㄟ^標準方法制備的重疊寡核苷酸裝 配完整多核苷酸，并裝配成完整編碼序列。參見，例如，Edge，yVatore，292:756 (1981); Nambair 等人，223:1299 (1984) ; Jay 等人，7；沿·ο7. CXe?·， 259:6311 (1984)。
[0139] 通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法，包括例如重組方法和化學合成，可以同時 摻入編碼抗體（或其部分）的核酸和選擇的氨基酸位置變化。
[0140] 抗-CD105 抗體 內(nèi)皮因子（⑶105)在細胞表面上表達為180 kDa同源二聚體跨膜蛋白。外部結(jié)構(gòu)域以 高親和力（50 nM)結(jié)合TGF-β 1和-3同種型，且⑶105的跨膜和細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與β聚糖共 有71%序列相似性。人CD105基因位于染色體9q34上（使用熒光原位雜交進行鑒定），編 碼區(qū)含有14個外顯子，已經(jīng)表征了具有結(jié)合TGF- β的能力的⑶105的2個不同同種型（L 和S)。L-⑶105由633個氨基酸殘基組成，其中47個氨基酸殘基在細胞質(zhì)尾巴中，這不同于 S-⑶105,后者由600個氨基酸殘基組成，其具有14個氨基酸細胞質(zhì)尾巴。但是，L-⑶105是 優(yōu)勢形式。⑶105在內(nèi)皮細胞中組成性地磷酸化，主要在絲氨酸和蘇氨酸殘基上，且該磷酸 化是由于在細胞內(nèi)組成活性的TGF- PRII。TGF- β與⑶105的結(jié)合導致磷酸化的下調(diào)， 這類似于用蛋白激酶C抑制劑觀察到的效應(yīng)。人CD105氨基酸序列含有位于胞外結(jié)構(gòu)域的 暴露區(qū)域中的三肽精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD)。RGD肽是在ECM蛋白（諸如纖連蛋 白、玻璃體結(jié)合蛋白、von Willebrand因子（vWF)、I型膠原和纖維蛋白原）上發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵 識別結(jié)構(gòu)，且被細胞表面整聯(lián)蛋白識別。整聯(lián)蛋白附著已經(jīng)涉及止血、血栓形成、血管生成 和炎癥，它們是其中內(nèi)皮起關(guān)鍵作用的過程（Duff等人，，17:984-992 (2003))。
[0141] ⑶105是TGF-β受體家族的一個成員，其由增殖中的內(nèi)皮細胞表達。內(nèi)皮 細胞增殖需要正常的CD105水平。CD105表達會被細胞低氧增加（通過低氧誘導因 子-I-a (HIF-1-α )的生產(chǎn)），并保護低氧細胞免于細胞凋亡。⑶105的幾種功能與TGF-β 信號傳導有關(guān)。TGF-β通過異源二聚體受體信號傳導，所述受體由絲氨酸激酶、受體I (RI) 和受體II (RII)組成。TGF-β與受體的外部結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，會暴露細胞質(zhì)的RII激酶活性， 所述活性會磷酸化TGF-β RI，后者然后可以與下游信號傳導物（諸如Smad蛋白）相互作 用。⑶105形成TGF-β受體復合物的一部分，但是它可以獨立地存在于細胞表面上。在許 多體外細胞中，CD105抑制TGF-β信號傳導。
[0142] ⑶105也結(jié)合其他生長因子，諸如激活蛋白A和骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP)-10、-9、-7 和-2。TGF-β或其他生長因子配體與⑶105的結(jié)合，需要至少存在受體RII，且它自己不 能結(jié)合配體。CD105與受體的結(jié)合不會改變它們對配體本身的親和力。在結(jié)合以后，CD105 的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域被TGF- β RI和TGF- β RII磷酸化；然后TGF- β RI (但是TGF- β RII不會） 激酶從受體復合物解離。
[0143] ⑶105表達抑制TGF- β RII的磷酸化水平，但是增加 TGF- β RI的磷酸化水平，導致 增加的Smad 2的磷酸化，但是不增加 Smad 3的磷酸化。由于Smad 2可以與多種轉(zhuǎn)錄因子、 輔活化劑和抑制劑相互作用，磷酸化的Smad 2可以起多種信號的整合物的作用，以調(diào)芐基 因轉(zhuǎn)錄。因而，⑶105調(diào)節(jié)TGF-β功能（通過與TGF-β RI和TGF-β RII的相互作用），并 修飾下游Smad蛋白的磷酸化。
[0144] CD105起調(diào)節(jié)TGF-β超家族的多種激酶受體復合物的信號傳導的作用，包括 TGF-β受體（TGF-PR)、激活蛋白受體-樣激酶（ALK)和激活蛋白受體。在沒有⑶105存 在下，TGF-β受體的活化導致SMD蛋白（SMAD 2和3)的磷酸化，這抑制內(nèi)皮細胞生長。但 是，TGF-β對⑶105的活化調(diào)節(jié)SMD蛋白磷酸化（包括SMD 1、5和8的磷酸化）。最終 結(jié)果是TGF-β受體活化對內(nèi)皮細胞的生長抑制作用的釋放（參見圖2)。不令人驚訝的是， 抗-⑶105抗體或反義寡核苷酸對⑶105活化的阻止，與TGF-β協(xié)同地起抑制內(nèi)皮細胞生 長的作用。
[0145] ⑶105啟動子的長度是2.6 kb，但是不含有TATA或CAAT轉(zhuǎn)錄起始盒。但是，它具 有2個富含6(：的區(qū)域：5?1、6丨8、64了4、4?-2、如?-0和1&1(1的共有基序，以及了6?-0應(yīng)答 元件。雖然如此，CD105具有相對受限的細胞分布。基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平似乎需要ets位點（在 位置-68處）和Spl位點，但是表達的相對受限（例如，限于內(nèi)皮細胞）似乎涉及多個調(diào)節(jié) 區(qū)，具體地，一個在-1294至-932處，另一個非常接近轉(zhuǎn)錄起始位點。⑶105被TGF-β上 調(diào)，這已經(jīng)表明需要在-37至-29處的Spl位點，還涉及一個或多個緊靠的上游的SBE位點， 所述位點結(jié)合Smads 3和/或4 (它們被TGF- β信號傳導活化）。低氧是缺血組織和腫瘤 的共同特征，且是血管內(nèi)皮細胞（EC)中的⑶105基因表達的有效刺激物。與TGF-β 1的組 合增強這樣的效應(yīng)。上調(diào)的CD105可以在低氧應(yīng)激下的EC中發(fā)揮自我保護作用。
[0146] 血管EC是⑶105的主要來源。其他細胞類型（包括血管平滑肌細胞、成纖維細胞、 巨噬細胞、前-B和骨髓單核細胞來源的白血病細胞以及紅細胞前體）在更低的程度上表達 CD105。
[0147] ⑶105涉及血管生成。反義實驗已經(jīng)證實，與TGF-β 1組合地抑制HUVEC中⑶105 表達，導致體外血管生成的顯著抑制，這表明⑶105是內(nèi)皮細胞中的促血管生成組分。 ⑶105在血管生成中的重要作用的其他證據(jù)來自⑶105敲除的小鼠。沒有⑶105的小鼠表 現(xiàn)出多種血管和心臟缺陷，導致在胚胎早期死亡。在沒有CD105的小鼠中觀察到的嚴重血 管損傷指示，成熟的血管在胚胎外脈管系統(tǒng)中的形成需要CD105,這進一步證實了 CD105在 血管生成中的直接作用。
[0148] CD105 (尤其也稱作內(nèi)皮因子或edg-Ι)是I型同源二聚體膜糖蛋白，其以高水平在 增殖中的血管內(nèi)皮細胞中表達。因而，CD105主要是經(jīng)歷活躍的血管生成的內(nèi)皮細胞的增殖 相關(guān)的標志物。但是，正常組織的血管內(nèi)皮可能存在有限的⑶105表達。已知人⑶105特 異性地結(jié)合轉(zhuǎn)化生長因子-β (TGF-β)，推導的⑶105氨基酸序列與β-聚糖（TGF-β受體 的一種類型）具有強同源性。
[0149] 在基于抗體的減少腫瘤脈管系統(tǒng)的方法中，已經(jīng)靶向⑶105,因為⑶105是在內(nèi)皮 和白血病細胞上的增殖相關(guān)的抗原。它在腫瘤相關(guān)的血管內(nèi)皮中的表達受到上調(diào)，CD105是 血管生成所必需的。血管生成包括新毛細血管的形成，這導致新生血管形成以及現(xiàn)有脈管 系統(tǒng)的維持。這是一個復雜的過程，該過程包括一系列相繼的步驟，包括內(nèi)皮細胞介導的血 管基膜和間質(zhì)基質(zhì)的降解、內(nèi)皮細胞的遷移、內(nèi)皮細胞的增殖和內(nèi)皮細胞的毛細血管袢的 形成。
[0150] CD105可以存在于：構(gòu)成和支持現(xiàn)有的脈管系統(tǒng)的細胞上，以及促進新脈管系統(tǒng) 的生長并變成新脈管系統(tǒng)的一部分的細胞上。這些抗體可以結(jié)合⑶105,并從而抑制血管生 成、抑制現(xiàn)有的脈管系統(tǒng)或現(xiàn)有脈管系統(tǒng)的維持和/或抑制小血管膨脹。除了它們用于純 化CD105的用途以外，這些抗體可用于純化、檢測和診斷目的以及治療目的。本文提供的抗 體可以用于配制用于治療多種狀況和疾病的藥物、治療所述狀況和疾病的方法和檢測方法 或診斷方法。本文使用的血管生成包括新血管的生長和/或發(fā)育（也稱作新生血管形成）、 小血管的膨脹、過度的或延長的血管生長和現(xiàn)有脈管系統(tǒng)的維持。血管生成狀況和疾病表 示與血管生成有關(guān)、由血管生成造成或伴隨血管生成的那些疾病和狀況。這樣的疾病的非 限制性實例包括，例如，各種形式的癌癥（原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移）。已經(jīng)產(chǎn)生了針對CD105的 鼠單克隆抗體（mAb)，它們調(diào)節(jié)CD105活性，并從而抑制血管生成和/或抑制小血管的血管 舒張。這些鼠抗體描述在美國專利5, 928, 641、6, 200, 566、6, 190, 660和7, 097, 836中，它 們中的每一篇以其整體并入本文。另外，已經(jīng)證實了許多這樣的抗體的先體外后體內(nèi)和體 內(nèi)有效性；結(jié)合CD105的單克隆抗體作為調(diào)節(jié)CD105的化合物是令人感興趣的。但是，鼠抗 體的治療性應(yīng)用是不可行的，因為鼠抗體的施用具有許多限制，包括例如人抗-小鼠抗體 (HAMA)形式的免疫原性。
[0151] 已經(jīng)描述了幾種抗-⑶105抗體，尤其是抗-⑶105單克隆抗體（"mAb"）。MAb SN6是用人白血病細胞的細胞膜的糖蛋白混合物免疫小鼠所生成的抗體（Haruta和Seon， 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83:7898-7902)。SN6 是一種識別人 CD105 的鼠 mAb。MAb 44G4是用人前-B白血病細胞的全細胞懸浮液免疫小鼠所生成的抗體（Gougos和Letarte， 1988, J. Immunol. 141:1925-1933; 1990, J. Biol. Chem. 265:8361-8364)。44G4 也是一種識別人CD105的鼠 mAb。Mb MJ7/18是用發(fā)炎的小鼠皮膚免疫大鼠所生成的抗 體（Ge 和 Butcher, 1994,同上）。MJ7/18 也是一種識別鼠 CD105 的 mAb。mAb Tec-Il 是 用人臍靜脈內(nèi)皮細胞免疫小鼠所生成的抗體（Burrows等人，1995, Ω7/?. Career Tfes. 1:1623-1634)。Tec-Il是一種具有限于人⑶105的反應(yīng)性的鼠 mAb。本文描述了結(jié)合⑶105 的嵌合抗體，其表現(xiàn)出減小的免疫原性，同時維持和/或提高它們的特異性。另外，為了解 決與鼠抗體有關(guān)的問題，本文描述了結(jié)合CD105并減少和/或抑制血管生成的嵌合抗體，其 表現(xiàn)出減小的免疫原性，同時維持和/或提高它們的特異性。這些抗-CD105抗體可用于 診斷和治療各種狀況和疾病，以及用于純化和檢測CD105。針對CD105的抗體代表用于治療 多種疾病和狀況（它們涉及血管生成，受血管生成的影響或作用）的療法的發(fā)展的一個重 要領(lǐng)域。
[0152] 本文提供了結(jié)合CD105的其抗體。也提供了它們的抗體（或抗原-結(jié)合片段），所 述抗體結(jié)合CD105,并抑制（部分地或完全地）或控制/治療（部分地或完全地）血管生成 /新生血管形成、小血管膨脹、抑制細胞增殖或抑制腫瘤生長。類似地，在抑制或結(jié)合CD105 的含義內(nèi)，也包括抑制CD105功能（例如，信號傳導、結(jié)合、活化等）。在另一個實施方案中， 抗體通過結(jié)合⑶105來抑制血管生成。本申請也提供了可以用于生產(chǎn)抗體的細胞系、用于 生產(chǎn)所述細胞系的方法、用于表達抗體和純化它們的方法。
[0153] 可以認識到，使用常規(guī)方法（包括，但不限于ELISA)，使用本文提供的或本領(lǐng)域已 知的試驗，可以測試使用本文所述方法產(chǎn)生的特異性地結(jié)合CD105的抗體的結(jié)合CD105的 能力。使用常規(guī)方法，包括但不限于Biacore或表面等離子體共振，也可以測定本文所述 抗體的親和力。
[0154] 本文提供了結(jié)合⑶105的抗體。本文也提供了結(jié)合⑶105并抑制血管生成的抗體。
[0155] 本文提供了一種抗體，其包含：具有SEQ ID NO: 1所述的氨基酸序列的輕鏈可變 區(qū)、具有SEQ ID NO: 2所述的氨基酸序列的輕鏈恒定區(qū)、具有SEQ ID NO: 3所述的氨基酸 序列的重鏈可變區(qū)和具有SEQ ID NO: 4所述的氨基酸序列的Yl(Yl)恒定區(qū)（Fe)。SEQ ID NO: 3所述；和具有SEQ ID NO: 4所述的氨基酸序列的恒定區(qū)（Fe)。
[0156] 在另一個非限制性實施方案中，所述抗⑶105抗體包含具有如SEQ ID NO:5所示 氨基酸序列的' CDRl;具有如SEQ ID N0:6所示氨基酸序列的八CDR2;具有如SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的\ CDR3;具有如SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的Vh CDRl;具有 如SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的Vh CDR2;和具有如SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列的Vh CDR3。
[0157] 在另一個非限制性實施方案中，分離的人源化的去免疫的抗CD105抗體可以包含 具有如SEQ ID NO: 11所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有如SEQ ID NO: 12所示氨基酸序 列的輕鏈可變區(qū)。人源化-去免疫重鏈的其他非限制性實例包括，但不限于，SEQ ID N0:13、 14、15