鑒定協(xié)同化妝品組合的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明一般來講涉及鑒定或評估用于個(gè)人護(hù)理組合物中的有益活性成分的組合 方法。更具體地，本發(fā)明涉及鑒定或評估抵抗氧化應(yīng)激反應(yīng)對皮膚細(xì)胞的效應(yīng)的活性物質(zhì) 的協(xié)同組合的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 生命的根本性基礎(chǔ)是生物體產(chǎn)生能量的需求和能力。在人類中，食物被攝入并轉(zhuǎn) 化為化合物諸如三磷酸腺苷（"ATP"）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（"NAD"），它們存儲(chǔ)被身 體的細(xì)胞用于進(jìn)行維持生命的生物學(xué)過程的能量。將食物的有用組分（例如，碳水化合物、 脂肪和蛋白質(zhì)）轉(zhuǎn)化為可用的能量的細(xì)胞代謝途徑是復(fù)雜的，并且可以尚未被全面地理解 的方式被多種因素影響。哺乳動(dòng)物的皮膚細(xì)胞也不例外。皮膚細(xì)胞已知包括以動(dòng)態(tài)的、復(fù)雜 的關(guān)系共同起作用，以維持皮膚的健康狀態(tài)的多種不同類型的細(xì)胞。例如，角質(zhì)細(xì)胞增殖和 分化，以提供皮膚的連續(xù)代謝周轉(zhuǎn)。已知黑素細(xì)胞提供用于皮膚色素沉積的黑素合成。而 成纖維細(xì)胞已知合成細(xì)胞外基質(zhì)和膠原，其幫助維持皮膚的厚度和彈性。相似地，存在于皮 膚或其他身體器官內(nèi)或周圍的其他細(xì)胞，諸如肌細(xì)胞、干細(xì)胞、皮脂腺細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、和脂 肪細(xì)胞，均需要來源于能夠被多種不同因素不利地影響的復(fù)雜代謝途徑的能量。
[0003] 各種緊張性刺激對細(xì)胞的生物能量學(xué)的影響和對細(xì)胞老化、以及其他疾?。ɡ?如，癌癥、神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、和心血管疾?。┑挠绊懙牧私庠絹碓蕉唷４x的改變在 疾病狀態(tài)中的一些這些效應(yīng)背后的一種理論是老化的自由基理論。即，哺乳動(dòng)物細(xì)胞暴露 于反應(yīng)性氧物質(zhì)（"ROS"）導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器諸如線粒體的損傷。ROS是包含氧的高 度反應(yīng)性的分子（例如，氧離子和過氧化物）。ROS作為氧的正常代謝的天然副產(chǎn)物在細(xì)胞 中天然地形成，并在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和體內(nèi)平衡中發(fā)揮作用。然而，當(dāng)細(xì)胞暴露于諸如熱或紫 外線輻射的緊張性刺激時(shí)，ROS水平能夠升高，并且在一些情況下顯著地升高。
[0004] 由于ROS導(dǎo)致的損傷隨著時(shí)間積累，其在細(xì)胞水平導(dǎo)致越來越多的氧化應(yīng)激反 應(yīng)，這最終可導(dǎo)致組織的損傷和/或器官功能障礙。氧化應(yīng)激反應(yīng)對細(xì)胞的一種效應(yīng)是細(xì) 胞的生物能量學(xué)能力的減弱，這能夠?qū)е陆档偷腁TP和/或NAD水平。這對于人類皮膚而言 可能是尤其成問題的，因?yàn)樵谌祟惼つw細(xì)胞上的氧化應(yīng)激反應(yīng)可顯示為老化的可見信號(hào)。 另外，諸如紫外線輻射（"UV"）和污染物（例如，香煙煙霧、汽車尾氣、臭氧）的環(huán)境緊張性 刺激能夠?qū)е翿OS產(chǎn)生水平的升高。隨時(shí)間推移，這可導(dǎo)致皮膚的結(jié)構(gòu)和形態(tài)的顯著變化 (例如，"光損傷"），并且，在更加極端的程度，導(dǎo)致皮膚癌。
[0005] 人類皮膚細(xì)胞通過利用諸如谷胱甘肽和NAD的氧化還原調(diào)節(jié)劑以及能夠中和ROS 的各種酶來抵御R0S。然而，這些防御能夠被緊張性刺激誘導(dǎo)的ROS的高峰擊敗，導(dǎo)致能量 內(nèi)穩(wěn)態(tài)和代謝效率的急性的以及慢性的改變，總體上導(dǎo)致細(xì)胞的功能障礙。使情況復(fù)雜的 是，與人類皮膚相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞類型的多樣性和這些細(xì)胞的代謝途徑的復(fù)雜性，使得難以鑒 定合適的化合物來幫助抵抗與暴露于特定的氧化緊張性刺激或緊張性刺激的組合相關(guān)聯(lián) 的抗衰老效應(yīng)。某些氧化緊張性刺激不同地影響不同類型的細(xì)胞和/或代謝途徑。這使得 難以選擇抵抗特定的一種或多種緊張性刺激的不期望的效應(yīng)的合適的護(hù)膚活性物質(zhì)或活 性物質(zhì)的組合（其效應(yīng)也可根據(jù)細(xì)胞或代謝途徑的類型而變化）。雖然鑒定防止、減少和/ 或逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激反應(yīng)對細(xì)胞的效應(yīng)的活性物質(zhì)是所期望的，甚至更加期望的是鑒定共同起 作用以提供優(yōu)于使用單種活性物質(zhì)的優(yōu)勢的活性物質(zhì)的組合。這有時(shí)被稱為協(xié)同作用。鑒 定單獨(dú)起作用以抵抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的效應(yīng)的護(hù)膚活性物質(zhì)能夠是困難的，而快速和/或有 效地鑒定協(xié)同地起作用的護(hù)膚活性物質(zhì)能夠是艱難的。因此，存在對鑒定抵抗與多種氧化 緊張性刺激（尤其是通常的環(huán)境緊張性刺激）相關(guān)聯(lián)的不期望的代謝效應(yīng)的護(hù)膚活性物質(zhì) 的協(xié)同組合的方法的需求。
[0006] 作為發(fā)現(xiàn)護(hù)膚活性物質(zhì)的協(xié)同組合的初始步驟，必須鑒定能夠檢測由緊張性刺激 和活性物質(zhì)導(dǎo)致的細(xì)胞代謝變化的方法。用于評估細(xì)胞的產(chǎn)能過程的多種方法是已知的。 例如，Clark型電極探針用于測量氧氣消耗是已知的。Clark電極提供動(dòng)力學(xué)信息（即，響 應(yīng)的速率），但其連續(xù)的氧氣消耗引入了偽跡（即，影響測試結(jié)果的一些不期望的和/或外 部的因子），呈現(xiàn)了測量腔室中對細(xì)胞或分離的線粒體的氧氣壓力的降低。盡管氧氣消耗可 提供線粒體功能的指示，其僅測量了細(xì)胞的生物能學(xué)的一部分，并且沒有提供對有助于生 物能學(xué)平衡的其他代謝途徑（即糖酵解）的評估。
[0007] 用于評估細(xì)胞的產(chǎn)能的另一個(gè)常規(guī)方法是通過測量細(xì)胞中ATP的量。用于對總的 能量代謝定量的發(fā)光ATP檢測試劑盒是可商購獲得的。ATP測定已知是相對靈敏的，但它 們可能不是線粒體功能的理想度量，因?yàn)榧?xì)胞盡力維持特定的ATP預(yù)算并將相應(yīng)地調(diào)整代 謝。因此，ATP水平的改變通常僅在病理生理改變期間可檢測。此外，ATP測定是破壞性的 (即，為了測量ATP的量，細(xì)胞被破壞）并且它們?nèi)鄙賱?dòng)力學(xué)信息。另外，來自垂死或死亡細(xì) 胞中存在的殘余ATP的偽跡已被報(bào)道。并且類似Clark電極測定，ATP不能確定不同的代 謝途徑對總的ATP產(chǎn)量的相對貢獻(xiàn)。
[0008] 另一種用于評估細(xì)胞能量學(xué)的常規(guī)方法是使用可商購獲得的MTT/XTT或 alamarBlue?試劑盒。雖然這些試劑盒可提供評估細(xì)胞健康狀態(tài)的相對簡單的方式，但它 們不像ATP測定那樣靈敏。此外，它們還被報(bào)道通過細(xì)胞毒性引入誤差，而這正好是它們預(yù) 期要測量的參數(shù)。另外，兩種測定均為破壞性的，并且不提供動(dòng)力學(xué)信息。
[0009] 因此，希望提供鑒定和/或評估減少、防止和/或逆轉(zhuǎn)在皮膚細(xì)胞上的不期望的氧 化應(yīng)激反應(yīng)的活性物質(zhì)的有益組合的方法。提供包括通過上述方法鑒定的護(hù)膚活性物質(zhì)的 護(hù)膚組合物也將是可取的。還將可取的是提供處理被特定緊張性刺激的氧化應(yīng)激效應(yīng)損傷 的皮膚的方法。
【附圖說明】
[0010] 圖1A、Ib和IC示出了角質(zhì)細(xì)胞的氧氣消耗速率。
[0011] 圖2示出了角質(zhì)細(xì)胞的氧氣消耗速率。
[0012] 圖3A、3B和3C示出了角質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞外酸化速率。
[0013] 圖4示出了角質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞外酸化速率。
[0014] 圖5A、5B、5C、ro和5E示出了成纖維細(xì)胞的氧氣消耗速率。
[0015] 圖6示出了成纖維細(xì)胞的氧氣消耗速率。
[0016] 圖7A、7B、7C、7D和7E示出了成纖維細(xì)胞的細(xì)胞外酸化速率。
[0017] 圖8示出了成纖維細(xì)胞的細(xì)胞外酸化速率。
[0018] 圖9示出了成纖維細(xì)胞的細(xì)胞外酸化速率。
[0019] 圖10示出了成纖維細(xì)胞的氧氣消耗速率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0020] 為了提供對前述問題的解決，本文公開了鑒定或評估用于個(gè)人護(hù)理組合物中的活 性物質(zhì)的協(xié)同組合的方法。所述方法包括：(a)提供第一測試容器、第二測試容器和第三測 試容器，每一測試容器包含配置在培養(yǎng)基中的細(xì)胞；(b)使所述第一測試容器中的細(xì)胞與 第一受試試劑接觸；（c)非致死地檢測所述第一測試容器中的細(xì)胞的與糖酵解代謝途徑和 氧化磷酸化代謝途徑各自相關(guān)聯(lián)的代謝指標(biāo)，以提供每一代謝途徑對所述第一受試試劑的 響應(yīng)；（d)使所述第二測試容器中的細(xì)胞與第二受試試劑接觸；（e)非致死地檢測所述第二 測試容器中的細(xì)胞的與糖酵解和氧化磷酸化代謝途徑各自相關(guān)聯(lián)的代謝指標(biāo)，以提供每一 代謝途徑對所述第二受試試劑的響應(yīng)；(f)使所述第三測試容器中的細(xì)胞與所述第一受試 試劑和第二受試試劑的組合接觸；(g)非致死地檢測所述第三測試容器中的細(xì)胞的與糖酵 解代謝途徑和氧化磷酸化代謝途徑各自相關(guān)聯(lián)的代謝指標(biāo)，以提供每一代謝途徑對所述第 一受試試劑和第二受試試劑的組合的響應(yīng)；以及（h)當(dāng)（g)中的糖酵解和氧化磷酸化代謝 途徑響應(yīng)中的至少一種是優(yōu)于（c)或（e)中的相同代謝途徑的對應(yīng)響應(yīng)的改善時(shí)，將所述 第一組合物和第二組合物的組合鑒定為活性物質(zhì)的有益的協(xié)同組合。
[0021] 在一些實(shí)施例中，所述方法可包括：(a)提供包括配置在第一培養(yǎng)基中的第一類 型細(xì)胞的第一測試容器和包括配置在第二培養(yǎng)基中的第二類型細(xì)胞的第二測試容器；(b) 提供所述第一類型細(xì)胞和第二類型細(xì)胞的糖酵解代謝途徑和氧化磷酸化代謝途徑各自的 基礎(chǔ)值；（c)使所述第一類型細(xì)胞和第二類型細(xì)胞與組合的第一受試試劑和第二受試試劑 接觸；（d)非致死地檢測與所述第一類型細(xì)胞和第二類型細(xì)胞的糖酵解和氧化磷酸化代謝 途徑各自相關(guān)聯(lián)的代謝指標(biāo)，以提供每一代謝途徑對組合的所述第一受試試劑和第二受試 試劑的響應(yīng)；以及（e)當(dāng)所述第一類型細(xì)胞和第二類型細(xì)胞各自的糖酵解和氧化磷酸化代 謝途徑中的至少一種的響應(yīng)表明優(yōu)于對應(yīng)的基礎(chǔ)值的改善時(shí)，將所述第一受試試劑和第二 受試試劑的組合鑒定為活性物質(zhì)的有益的組合。
[0022] 在一些實(shí)施例中，所述方法可包括：(a)提供第一測試容器、第二測試容器和第三 測試容器，每一測試容器包含配置在培養(yǎng)基中的細(xì)胞；(b)使所述第一測試容器中的細(xì)胞 與第一受試試劑接觸；（c)非致死地檢測所述第一測試容器中的細(xì)胞的與糖酵解代謝途徑 和氧化磷酸化代謝途徑各自相關(guān)聯(lián)的代謝指標(biāo)，以提供每一代謝途徑對所述第一受試試劑 的響應(yīng)；（d)使所述第二測試容器中的細(xì)胞與第二受試試劑接觸；（e)非致死地檢測所述第 二測試容器中的細(xì)胞的與糖酵解和氧化磷酸化代謝途徑各自相關(guān)聯(lián)的代謝指標(biāo)，以提供每 一代謝途徑對所述第二受試試劑的響應(yīng)；（f)使所述第三測試容器中的細(xì)胞與所述第一受 試試劑和第二受試試劑的組合接觸；（g)非致死地檢測所述第三測試容器中的細(xì)胞的與糖 酵解代謝途徑和氧化磷酸化代謝途徑各自相關(guān)聯(lián)的代謝指標(biāo)，以提供每一代謝途徑對所述 第一受試試劑和第二受試試劑的組合的響應(yīng)；以及（h)當(dāng)（g)中的糖酵解和氧化磷酸化代 謝途徑響應(yīng)中的至少一種不劣于（c)和（e)中的相同代謝途徑的響應(yīng)，并且所述第一受試 試劑和第二受試試劑中的至少一種提供優(yōu)于所述第一受試試劑和第二受試試劑中的另一 個(gè)的非代謝的有益效果時(shí)，將所述第一受試試劑和第二受試試劑的組合鑒定為活性物質(zhì)的 有益的組合。
[0023] 在一些實(shí)施例中，公開了包含護(hù)膚活性物質(zhì)的協(xié)同組合的個(gè)人護(hù)理組合物，所述 組合物包含：(a)皮膚病學(xué)可接受的載體；(b)作為第一活性物質(zhì)的安全且有效量的煙酰 胺；和（c)作為第二活性物質(zhì)的安全且有效量的生育醌，其中所述安全且有效量的煙酰胺 和生育醌的組合改善由于暴露于緊張性刺激而遭受氧化應(yīng)激反應(yīng)的皮膚細(xì)胞的糖酵解和 氧化磷酸化代謝中的至少一種，并提供優(yōu)于單獨(dú)使用所述活性物質(zhì)的協(xié)同的優(yōu)勢。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 除非另外指明，所有百分比均按個(gè)人護(hù)理組合物的重量計(jì)。除非另外特別說明，所 有的比率均為重量比。所有數(shù)值范圍是包括端值在內(nèi)的較窄的范圍；描述的范圍上限和下 限是可互換的，以形成沒有明確描述的其它范圍。有效數(shù)位的數(shù)字既不限制所指示的量也 不限制測量精度