一種建立急性病毒性肝炎動(dòng)物模型的方法
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及肝臟免疫學(xué)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種建立急性病毒性肝炎動(dòng)物模型的方法。
【【背景技術(shù)】】
[0002]肝炎是嚴(yán)重危害人民生命健康且死亡率較高的一種疾病，病因主要包括病毒感染、過度酒精攝入和服入化學(xué)毒物等造成肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞的破壞，其致病機(jī)制復(fù)雜。由于人體肝臟標(biāo)本的缺乏以及體外研究的局限性，建立實(shí)驗(yàn)性肝臟損傷動(dòng)物模型，模擬人類肝臟疾病，研究肝炎的發(fā)病機(jī)制，篩選治療肝炎的藥物，具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0003]其中肝臟免疫損傷備受關(guān)注，特別是肝臟淋巴細(xì)胞參與的病理損傷已經(jīng)成為多種肝炎發(fā)病機(jī)制中至關(guān)重要的因素，現(xiàn)有技術(shù)中公開了由刀豆蛋白(concanavalin A)誘導(dǎo)的肝炎模型，該模型將刀豆蛋白以15微克/克體重(μ g/g.wt)靜脈注射小白鼠，導(dǎo)致T細(xì)胞依賴的肝損傷；現(xiàn)有技術(shù)中還公開了自然殺傷T細(xì)胞，即NKT細(xì)胞，通過Fas配體介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性參與刀豆蛋白誘導(dǎo)的肝炎模型；以及巨噬細(xì)胞(肝臟內(nèi)的Kupffer細(xì)胞)通過分泌腫瘤壞死因子TNF參與刀豆蛋白誘導(dǎo)的肝炎模型。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)中的肝炎模型多為化學(xué)性損傷或免疫損傷，都無法很好的模擬病毒性感染引起的肝炎，因此無法指導(dǎo)病毒性肝炎的臨床研究及藥物的開發(fā)，而我國乙肝、甲肝、丙肝發(fā)病率居高，急需要病毒性肝炎模型支持對病毒性肝炎治療的研究。因此，現(xiàn)有技術(shù)中公開了 D-氨基半乳糖與微量細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)共處理引起肝臟損傷的動(dòng)物模型，該模型中D-氨基半乳糖與LPS處理小白鼠后，小白鼠對LPS敏感性明顯增強(qiáng)，弓丨起小白鼠急性肝臟損傷，伴有嚴(yán)重肝臟充血和壞死，甚至出現(xiàn)死亡，LPS可以通過與Toll樣受體2、4結(jié)合，刺激淋巴細(xì)胞分泌炎性淋巴因子，引起肝臟局部炎癥。
[0005]上述D-氨基半乳糖與LPS協(xié)同使用，雖然可以模擬病毒性肝炎，但該模型中LPS可刺激多種Toll樣受體，且誘導(dǎo)較慢，也無法模擬病毒性感染引起的急性肝損傷。
[0006]因此，建立出一種模擬效果好的急性病毒性肝炎動(dòng)物模型成為亟待解決的問題。
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【發(fā)明內(nèi)容】
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[0007]本發(fā)明的目的在于克服上述不足之處，提供一種建立急性病毒性肝炎動(dòng)物模型的方法，解決現(xiàn)有技術(shù)中模擬病毒性感染引起的急性肝損傷效果不佳的技術(shù)問題。
[0008]本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題所采用的方案如下:
[0009]一種建立急性病毒性肝炎動(dòng)物模型的方法，包括以下步驟:
[0010]步驟1:從純系小白鼠(純系BALB/c小鼠)、純系B6小鼠(純系C57BL/6J小鼠)、純系嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)小鼠、純系裸鼠(純系BALB/c背景的裸鼠)或純系分化抗原Id (⑶)缺陷小鼠(純系BALB/c背景的小鼠)中選擇至少一組小鼠；
[0011]步驟2:用無菌磷酸緩沖溶液(PBS溶液)配制D-氨基半乳糖溶液，用無菌磷酸緩沖溶液配制多聚肌苷酸:多聚胞苷酸溶液；
[0012]步驟3:對步驟I所選的每組純系小鼠分別注射D-氨基半乳糖溶液和多聚肌苷酸:多聚胞苷酸溶液，其中，D-氨基半乳糖每克體重劑量范圍是0.15?0.5mg，多聚肌苷酸:多聚胞苷酸每克體重劑量范圍是0.03?0.5 μ g ;
[0013]步驟4:D-氨基半乳糖溶液和多聚肌苷酸:多聚胞苷酸溶液腹腔注射或靜脈注射后6?24小時(shí)，收集血液后分離血清，檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)活性，結(jié)果為300?800U/L，則急性病毒性肝炎動(dòng)物模型建立成功。
[0014]優(yōu)選地，所述步驟I中所選的為6?8周齡的純系小白鼠。
[0015]優(yōu)選地，所述步驟2中的D-氨基半乳糖溶液終濃度為15?30 μ g/μ 1，多聚肌苷酸:多聚胞苷酸溶液終濃度為5?1ng/μ I。
[0016]優(yōu)選地，所述步驟3中D-氨基半乳糖每克體重劑量是0.5mg，多聚肌苷酸:多聚胞苷酸每克體重劑量范圍是0.03 μ g。
[0017]優(yōu)選地，所述步驟4收集血清的時(shí)間為D-氨基半乳糖溶液和多聚肌苷酸:多聚胞苷酸溶液注射后12?18小時(shí)。
[0018]優(yōu)選地，所述步驟4除檢測血清丙氨酸轉(zhuǎn)移酶活性外還包括檢測血清天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶(AST)活性；以及收集小鼠肝臟標(biāo)本，顯微鏡下觀察肝臟組織學(xué)變化；血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性和天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶活性均為300?800U/L，肝臟組織學(xué)出現(xiàn)肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，則急性病毒性肝炎動(dòng)物模型建立成功。
[0019]優(yōu)選地，所述步驟4中D-氨基半乳糖溶液的注射方式為腹腔注射，多聚肌苷酸:多聚胞苷酸溶液的注射方式為尾靜脈注射。
[0020]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于，本發(fā)明的建立急性病毒性肝炎動(dòng)物模型的方法通過D-氨基半乳糖和多聚肌苷酸:多聚胞苷酸協(xié)同作用，迅速誘導(dǎo)肝炎癥狀，對病毒性感染模擬效果好。
【【附圖說明】】
[0021]圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的建立急性病毒性肝炎動(dòng)物模型的方法的流程圖；
[0022]圖2是本發(fā)明實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)組和對照組ALT活性對比圖；
[0023]圖3是本發(fā)明實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)組和對照組AST活性對比圖。
【【具體實(shí)施方式】】
[0024]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0025]本發(fā)明的建立急性病毒性肝炎動(dòng)物模型的方法利用D-氨基半乳糖、多聚肌苷酸:多聚胞苷酸協(xié)同作用，能夠迅速引起肝炎，激活Toll受體信號通路，對病毒性感染模擬效果好。
[0026]其中，D-氨基半乳糖又稱半乳糖胺或軟骨糖胺，具有細(xì)胞毒性，其特異性導(dǎo)致肝損傷的機(jī)制尚不明確，D-氨基半乳糖通過消耗肝臟尿嘧啶三磷酸核苷酸，抑制肝細(xì)胞RNA合成；另外D-氨基半乳糖還可以引起肝細(xì)胞內(nèi)Ca2+增多，Mg2+減少，Mg2VCa2+的比例失調(diào)，這可能也是D-氨基半乳糖導(dǎo)致肝細(xì)胞不可逆損害的因素之一；多聚肌苷酸:多聚胞苷酸溶液(polyinosinic acid-polycytidylic ac i d, po lyinos ini c-po Iycy tidy lie acid,簡稱 PolyIC)是一種人工合成的雙鏈核糖核酸(RNA)，能夠刺激、活化自然免疫細(xì)胞分泌干擾素，自然免疫細(xì)胞被過度活化導(dǎo)致肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞被破壞，本發(fā)明中所采用的多聚肌苷酸:多聚胞苷酸為病毒模擬物，其刺激機(jī)體產(chǎn)生的反應(yīng)類似于病毒感染反應(yīng)。
[0027]本發(fā)明的方法中一般選用純系BALB/c小鼠、純系C57BL/6J小鼠、純系嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)小鼠、純系BALB/c背景的裸鼠或純系分化抗原Id (CD)缺陷小鼠(純系BALB/c背景的小鼠)中的一組。作為一個(gè)優(yōu)選方案，選用6?8周齡的純系BALB/c小鼠或純系C57BL/6J小鼠，大于8周的小鼠肝臟損傷不明顯，更優(yōu)選地，選用6?8周齡的純系BALB/c 小鼠。
[0028]本發(fā)明的方法中D-氨基半乳糖溶液、多聚肌苷酸:多聚胞苷酸溶液的注射可以采用腹腔注射或者靜脈注射，采用腹腔注射較方便，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，D-氨基半乳糖溶液采用腹腔注射，多聚肌苷酸:多聚胞苷酸溶液采用尾靜脈注射。
[0029]急性病毒性感染的效果與肝損傷的程度與D-氨基半乳糖溶液、多聚肌苷酸:多聚胞苷酸溶液的注射劑量有關(guān)，與D-氨基半乳糖與多聚肌苷酸:多聚胞苷酸的劑量比也有關(guān)，D-氨基半乳糖每克體重劑量范圍在0.15?0.5mg，多聚肌苷酸:多聚胞苷酸每克體重劑量范圍在0.03?0.5 μ g時(shí)，效果較佳，隨著劑量的增加，肝臟損傷較嚴(yán)重，死亡率急劇增力口，如果劑量較低，則達(dá)不到急性病毒性感染的效果。
[0030]D-氨基半乳糖溶液和多聚肌苷酸:多聚胞苷酸溶液注射后6?24小時(shí)，動(dòng)物食量變差，毛發(fā)豎直，血清轉(zhuǎn)氨酶升高，此時(shí)，急性病毒性肝炎動(dòng)物模型建立成功。一般情況下，ALT活性在300?800U/L時(shí)，動(dòng)物模型建立成功；為了進(jìn)一步增加動(dòng)物模型的感染效果，注射后6?24小時(shí)收集血液后分離血清，檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)活性和血清天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶(AST)活性，收集小鼠肝臟標(biāo)本，顯微鏡下觀察肝臟組織學(xué)變化，血清轉(zhuǎn)氨酶升高，肝臟組織學(xué)出現(xiàn)肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，ALT活性和AST活性一般在300?800U/L，急性病毒性肝炎動(dòng)物模型建立效果較好。
[0031]實(shí)施例1
[0032]本發(fā)明實(shí)施例1提供了一種建立急性病毒性肝炎動(dòng)物模型的方法，如圖1所示，包括以下步驟:
[0033]步驟SlOl:不同純系小鼠的準(zhǔn)