果 多酚也可以通過下述方法提取獲得：
[0033] 將蘋果洗凈、切碎，稱取50Kg浸泡于濃度為0.Olg/ml的維生素C的水溶液中，破 碎后用體積比為60 %和乙醇水溶液60°C浸提2h，每批提取兩次，合并提取液，真空濃縮干 燥，最后得蘋果多酚粗體物200g(經(jīng)Folin-Ciocalteu比色法檢測，總多酚含量占提取物總 量的80% )。
[0034] 實(shí)施例2蘋果多酚醇提物的制各
[0035] 將6質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蘋果多酚（多酚，81.8% ;綠原酸，15. 3% ;原花青素B2,6. 36% ; 根皮苷，5. 12% ;批號：1310019-14,天津市尖峰天然產(chǎn)物研宄開發(fā)有限公司）。用80~ 100的質(zhì)量份數(shù)的水進(jìn)行溶解分散，進(jìn)行大孔樹脂柱色譜層析，采用的樹脂有HP20、D101、 AB-8等二苯乙烯類大孔樹脂。樹脂層析柱的上樣流速為0. 3~0. 7BV/h，然后樹脂柱用水、 體積比分別為30 %乙醇水溶液、50 %乙醇水溶液和90 %乙醇水溶液各洗脫4~6BV(柱保 留體積），洗脫流速分別1~I. 5BV/h，30%乙醇水溶液洗脫部位、50 %乙醇水溶液洗脫部 分和90%乙醇水溶液洗脫部位分別收集后各自在溫度60度，真空度為低于0. 09MPa進(jìn)行 減壓濃縮至糖度為25-35,進(jìn)行噴霧干燥，產(chǎn)品過80-100目藥篩，得到蘋果多酚30%醇提物 (八?-30)、50%醇提物（4?-50)和90%醇提物仏?-90)。
[0036] 實(shí)施例3蘋果多酚體積比為50%的乙醇水溶液提物物的活件確宙
[0037] 1、儀器與材料
[0038] 低速自動平衡離心機(jī)（河北省安新縣離心機(jī)廠），Model680酶標(biāo)儀（Bio-RAD公 司），恒溫培養(yǎng)箱（常州朗越儀器制造有限公司），F(xiàn)A1204B型電子天平（上海愛朗公司）， 微型旋渦混合儀（上海瀘西分析儀器廠），電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）， 4°C離心機(jī)3-30K型（Sigma)，熒光顯微鏡CKX41型（OLYMPUS)，DYY-4C型電泳儀（北京市 六一儀器廠）。
[0039] RIN-m5F胰島0細(xì)胞（由中國科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥物研宄所提供）， 蘋果多酚（多酚，81.8%;綠原酸，15. 3%;原花青素B2,6.36%;根皮苷，5. 12% ;批號： 1310019-14,天津市尖峰天然產(chǎn)物研宄開發(fā)有限公司），RPMI1640培養(yǎng)液（北京索萊寶科 技有限公司），胎牛血清（浙江四季青生物工程有限公司），胰蛋白酶（北京鼎國昌盛生物 技術(shù)有限公司），PBS(北京索萊寶科技有限公司），MTT(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司）， A0/EB雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（上海貝博生物公司），30%H2O2溶液（分析純，天津市風(fēng) 船化學(xué)試劑科技有限責(zé)任公司）
[0040] MTT法測蘋果多酚50%醇提物對胰島RIN-m5F0細(xì)胞增殖作用
[0041] 胰島RIN-m5Ff3細(xì)胞用含10%胎牛血清的RIPM培養(yǎng)液培養(yǎng)，在培養(yǎng)瓶中長滿至 單層后，2.5g/L胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，以每孔I.OXIO4個細(xì)胞接種于96孔板中， 每孔加100UL，并設(shè)不含藥物的空白調(diào)零孔，在5%CO2、37°C飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h后，每孔分別加100y1不同濃度蘋果多酚、蘋果多酚30%醇提物、50%醇提物和90%醇 提物的樣品溶液，每個濃度設(shè)置3個平行孔，培養(yǎng)24h后倒置顯微鏡拍片觀察。然后每孔加 入濃度為5mg/L的MTT20yl，常規(guī)孵育4h。吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150yL二甲基亞砜，振 蕩IOmin，使結(jié)晶物溶解充分均勾，用酶標(biāo)儀490nm處比色，測其各自的OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖 率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)三次。
[0042] 結(jié)果如表1所示，顯示蘋果多酚和蘋果多酚50%乙醇提物有效促進(jìn)胰島細(xì)胞增 殖，且蘋果多酚50%乙醇提物作用優(yōu)于蘋果多酚，具有顯著性差異（P〈0. 05)。
[0043] 表1蘋果多酚各極性部位對胰島細(xì)胞促增殖作用比較
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種蘋果多酚乙醇提取物，其特征在于，按重量百分比計(jì)，所述蘋果多酚乙醇提 取物包含綠原酸（。111〇1'〇8611；[。3(^(1)0.8~1.5%，咖啡酸（。&打6；[。&(^(1&(^(1)1.0~ 1. 6 %，表兒茶素（epicatechin) 0? 3 ~0? 8 %，5_0_ 對香 S 醜査尼酸（5-〇-p-coumaric acyl quinic acid)3 ~4 %，4-〇_ 對香豆?？崴幔?-〇-p-coumaric acyl quinic acid) 5. 5 ~6. 5 %，對香 S 酸（p-coumaric acid) 0? 5 ~1.0 %，l-〇-咖啡醜査尼酸甲 醋（1-0-Caffeoylquinic acid methyl ester)0.3 ~1.2%，4-〇_ 對香豆?？崴峒状?(4-〇-p-coumaric acyl quinic acidmethyl ester)0.3 ~0.9%，3_羥基根皮素-2'木糖 葡萄糖苷（3-Hydroxyphloretin-2' _xyloglucoside)3. 0 ~4. 0%，羥基根皮苷（3-hydroxy phloridzin) 1. 2 ~2. 0%，根皮素-2'木糖葡萄糖苷（phloretin_2'-xylglucoside) 15 ~ 18%，根皮素-2'木糖半乳糖苷（Phloretin_2'-xylogalactoside)2.0 ~3.0%，根皮苷 (phloridzin) 20 ~26%，根皮素（phloretin) 0? 2 ~0? 8%。
2. 如權(quán)利要求1所述的蘋果多酚乙醇提取物的制備方法，其特征在于，所述制備方法 的步驟為： 1) 將6質(zhì)量份數(shù)的蘋果多酚溶解分散于80-100質(zhì)量份數(shù)的水中； 2) 將步驟1)得到的溶液通過大孔樹脂柱色譜層析，以0. 3~0. 7柱保留體積/小時的 流速上樣，相繼用水、體積比分別為30%、50 %以及90%的乙醇水溶液各洗脫4~6柱保留 體積，洗脫流速為1~1. 5柱保留體積/小時，獲得體積比為50%的乙醇水溶液的洗脫液； 3) 將所述體積比為50 %的乙醇水溶液的洗脫液真空干燥至紅色粉末，即得到蘋果多 酚乙醇提取物。
3. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟1)所述的蘋果多酚是通過包括以 下步驟的方法制備的： 將蘋果洗凈、切碎，并浸泡于濃度為〇. Olg/ml維生素C的水溶液中，破碎后用60 %乙醇 水溶液60°C浸提2h，每批提取兩次，合并提取液，真空濃縮干燥，最后得蘋果多酚粗體物。
4. 如權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其特征在于，步驟2)所述大孔樹脂為二苯乙烯 類大孔樹脂，優(yōu)選地選自HP20、D101、AB-8中的一種。
5. 如權(quán)利要求2~4中任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，所述50%乙醇洗脫液在 60°C、真空度低于0. 09MPa的條件下減壓濃縮至糖度為25~35,然后噴霧干燥并過藥篩； 優(yōu)選地，所述藥篩為80~100目藥篩。
6. 如權(quán)利要求1所述的蘋果多酚乙醇提取物在制備提高胰島細(xì)胞活性和促進(jìn)胰島細(xì) 胞增殖的藥物中的應(yīng)用。
7. 如權(quán)利要求1所述的蘋果多酚乙醇提取物在制備保護(hù)胰島細(xì)胞抵御氧化損傷的藥 物中的應(yīng)用。
8. 如權(quán)利要求1所述的蘋果多酚乙醇提取物在制備預(yù)防和/或治療糖尿病的中的用 途。
9. 一種用于預(yù)防和/或治療糖尿病的藥物組合物，其包含如權(quán)利要求1所述的蘋果多 酚乙醇提取物。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物還包含藥學(xué)上上 可接受的輔料和/或其它預(yù)防和/或治療糖尿病的藥物。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種蘋果多酚乙醇提取物，包括綠原酸0.8～1.5％，咖啡酸1.0～1.6％，表兒茶素0.3～0.8％，5-O-對香豆?？崴?～4％，4-O-對香豆酰奎尼酸5.5～6.5％，對香豆酸0.5～1.0％，1-O-咖啡酰奎尼酸甲酯0.3～1.2％，4-O-對香豆?？崴峒柞?.3～0.9％，3-羥基根皮素-2′木糖葡萄糖苷3.0～4.0％，羥基根皮苷1.2～2.0％，根皮素-2′木糖葡萄糖苷15～18％，根皮素-2′木糖半乳糖苷2.0～3.0％，根皮苷20～26％，根皮素0.2～0.8％。本發(fā)明還提供了蘋果多酚乙醇提取物的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明具有抑制體重、保護(hù)胰島細(xì)胞、降血糖的效果。
【IPC分類】A61P3-10, A61K36-73, A61P5-50
【公開號】CN104721301
【申請?zhí)枴緾N201510014058
【發(fā)明人】劉岱琳, 宋光明, 趙艷敏, 謝文利
【申請人】中國人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2015年1月12日