類彈性蛋白多肽制備的軟組織分離制劑及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及類彈性蛋白多肽制備的軟組織分離制劑及應(yīng)用，屬于類彈性蛋白多肽的醫(yī)藥配置品及用途。
技術(shù)背景
[0002]在消化道內(nèi)窺鏡治療中，內(nèi)窺鏡下黏膜切除術(shù)(EMR)及內(nèi)窺鏡黏膜下剝離術(shù)(ESD)是目前廣泛應(yīng)用于切除消化道癌前病變與消化道早期腫瘤的標(biāo)準(zhǔn)微創(chuàng)治療手段。它們不僅可以使患者避免外科開腹手術(shù)的痛苦，還可以進(jìn)行剝離后組織回收，進(jìn)行病理學(xué)診斷，指導(dǎo)術(shù)后復(fù)查及進(jìn)一步治療，因此逐漸成為治療治療早期消化道腫瘤的首選方法。盡管這種內(nèi)鏡下治療具有方法簡(jiǎn)便、創(chuàng)傷性小，療效可靠的優(yōu)勢(shì)，但是其操作技術(shù)難度高，存在著相當(dāng)比例的穿孔、出血等并發(fā)癥，因而要求操作者具有更加熟練的操作技術(shù)，限制了其臨床應(yīng)用的發(fā)展和提尚。
[0003]在內(nèi)鏡治療操作中，有效的黏膜下軟組織分離制劑注射，可使使黏膜下層與固有肌層分離，有效的分離病變組織與正常組織，以便于操作，預(yù)防和減少并發(fā)癥，已成為提高內(nèi)鏡下黏膜切除治療安全性的有效措施。但是，傳統(tǒng)的軟組織分離制劑如生理鹽水等，在注射后的維持時(shí)間短、重復(fù)注射率高，不能有效地減少內(nèi)鏡治療并發(fā)癥的發(fā)生率，大大降低了內(nèi)鏡治療的安全性。因此非常有必要尋找新型理想的軟組織分離制劑以提高內(nèi)鏡下黏膜切除治療的高效性和安全性。
[0004]類彈性蛋白多肽(Elastin-like polypeptides, ELPs)是一種用基因工程方法獲得的蛋白質(zhì)聚合物，其結(jié)構(gòu)主要由五肽重復(fù)序列(Val-Pro-Gly-Xaa-Gly，即纈氨酸-脯氨酸-甘氨酸-X氨基酸-甘氨酸)構(gòu)成，來源于彈性蛋白的疏水區(qū)域，其中Xaa可以是除脯氨酸以外任一氨基酸。它具有一定的熱敏性，當(dāng)環(huán)境溫度低于類彈性蛋白多肽的轉(zhuǎn)相溫度時(shí)，類彈性蛋白多肽呈液體狀態(tài)；而當(dāng)環(huán)境溫度高于轉(zhuǎn)相溫度時(shí)，類彈性蛋白多肽聚集呈凝膠狀。由于類彈性蛋白多肽具有這種特殊性質(zhì)，加之有良好的組織相容性、非免疫原性，這為其在生物醫(yī)學(xué)材料方面的研宄和利用提供了依據(jù)。
[0005]目前，類彈性蛋白多肽多在組織工程上應(yīng)用。其水凝膠體已成功應(yīng)用于軟骨、椎骨的組織修復(fù)、血管的移植、膀胱干細(xì)胞基體神經(jīng)引導(dǎo)干細(xì)胞薄片及手術(shù)后的傷口愈合。另外，其在靶向腫瘤和構(gòu)造藥物載體微粒方面也取得了一定的研宄進(jìn)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明就是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中，傳統(tǒng)的軟組織分離制劑在注射后的維持時(shí)間短、重復(fù)注射率高，不能有效地減少內(nèi)鏡治療并發(fā)癥的發(fā)生率，提高內(nèi)鏡治療的安全性等問題，而提供一種以類彈性蛋白多肽制備的軟組織分離制劑及應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明是按照以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
[0008]一種類彈性蛋白多肽制備的軟組織分離制劑，將類彈性蛋白多肽風(fēng)干絮狀固體物質(zhì)溶于磷酸鹽緩沖液制成的終濃度為500uM-1000uM的液體制劑，尤其是濃度為500 uM。
[0009]類彈性蛋白多肽分子量為50kD，純度為大于99%。
[0010]本發(fā)明所述的類彈性蛋白多肽制備的軟組織分離制劑具有溫敏特性，當(dāng)溫度超過其相變溫度37°C時(shí)，其可由液態(tài)轉(zhuǎn)化為凝膠狀態(tài)。
[0011]本發(fā)明所述的類彈性蛋白多肽制備的軟組織分離制劑的使用量為單次注射5-lOmlο
[0012]一種類彈性蛋白多肽制備的軟組織分離制劑的應(yīng)用，其是將類彈性蛋白多肽制備的軟組織分離制劑填充于胃腸道黏膜下層，類彈性蛋白多肽相變?yōu)槟z狀，使胃腸黏膜與固有肌層充分分離。
[0013]使用時(shí)，利用消化內(nèi)鏡進(jìn)鏡，到達(dá)操作部位，在內(nèi)鏡下通過注射針，于黏膜下層注射類彈性蛋白多肽制備的軟組織分離制劑，待黏膜與固有肌層充分分離，進(jìn)行病變黏膜剝離切除。
[0014]本發(fā)明的有益效果是:在內(nèi)鏡治療操作中，應(yīng)用類彈性蛋白多肽制備的軟組織分離制劑注射于胃腸道黏膜下層，使黏膜與固有肌層充分的分離，以利于完全切除病變組織。該軟組織分離制劑在體溫下，由注射時(shí)的液相流動(dòng)狀態(tài)變相為類凝膠狀態(tài)，使注射后的軟組織分離距離顯著增加，且保留時(shí)間延長，而不需多次注射，為手術(shù)提供良好視野和操作空間，從而提高成功率和減少手術(shù)時(shí)間，大大減低了內(nèi)鏡治療并發(fā)癥如穿孔、出血的發(fā)生；該軟組織分離制劑具有良好的生物相容性，無毒副作用；其可降解特性更消除了異物殘留的擔(dān)憂。由于本發(fā)明適用于消化內(nèi)鏡下治療中的軟組織分離，以便切除病變組織，使操作更安全有效。
【附圖說明】
[0015]圖1是不同黏膜下注射劑對(duì)SD大鼠胃黏膜厚度隨時(shí)間變化的影響；
圖2是每一時(shí)間點(diǎn)各組間黏膜厚度變化的對(duì)比圖；
圖3是30min時(shí)不同注射液維持黏膜厚度的組織學(xué)表現(xiàn)；
圖4是黏膜切除后20min出血量對(duì)比圖；
圖5是注射ELPs內(nèi)鏡下黏膜剝離術(shù)標(biāo)記圖；
圖6是黏膜下注射ELP后黏膜的隆起；
圖7黏膜剝離邊緣圖；
圖8是黏膜切除圖；
圖9是黏膜剝離形成的人工潰瘍圖；
圖10是黏膜剝尚術(shù)后人工潰瘍2周圖；
圖11是黏膜剝尚術(shù)后人工潰瘍4周圖；
圖12是黏膜剝尚術(shù)后潰瘍愈合圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。
[0017]本發(fā)明所述的類彈性蛋白多肽為ELP120_Tyr7，含有7個(gè)酪氨酸，其分子量為50KDa，純度為大于99%，應(yīng)用濃度為500 uM，相變溫度為37°C (500uM)。
[0018]一.類彈性蛋白多肽的制備 1.類彈性蛋白多肽的制備方法:
①將表達(dá)類彈性蛋白多肽的載體轉(zhuǎn)入到大腸桿菌表達(dá)菌株中；
②含有pET-22b-ELPS重組質(zhì)粒的BL21工程菌按1: 100的接種量接種到含100Ug/mL氨芐青霉素的TB培養(yǎng)基中(每升TB培養(yǎng)基中含12 g蛋白胨，24 g酵母浸提物，2.31 g磷酸氫二鉀，12.54 g磷酸二氫鉀，4 mL甘油)，37°C下250 r/min培養(yǎng)24 h ；
③在4°C, 4 000 r/min離心15 min，收獲菌體，用預(yù)冷的PBS緩沖液(137 mmol/LNaCl, 2.7 mmol/L KCl，4.2 mmol/L NaH2P04，1.4 mmol/LKH2P04,pH 為 7.3)重懸菌體，然后置冰浴中超聲破碎(超聲2s,間隔3s，共5min)；
④類彈性蛋白多肽s純化采用可逆相變循環(huán)(Inversetransit1n cycling，ITC)，即在大腸桿菌破碎液，向其加入聚乙烯亞胺(終濃度為0.5%)以去除核酸；4 °C, 13 000r/min離心15min，取上清；向上清液中添加NaCl至終濃度為2 mol/L, 37 °C水浴15 min后，13 000 r/min，離心15 min去上清向沉淀中加入預(yù)冷的PBS溶解沉淀，冰浴15 min后，4°C、13 000 r/min，離心15 min ;向上清液中再添加NaCl至終濃度為2 mol/L，37°C水浴15 min后，13 000 r/min，離心15 min去上清；向沉淀中加入預(yù)冷的PBS溶解沉淀，冰浴15 min, 4 °C、13 000 r/min，離心15 min，收集上清液，以上過程為兩輪ITC。
[0019]2.類彈性蛋白多肽純度和分子量測(cè)定:聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)類彈性蛋白多肽純度。應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD1-MS)方法檢測(cè)的類彈性蛋白多肽分子量。
[0020]3.類彈性蛋白多肽相變溫度測(cè)定:測(cè)定類彈性蛋白多肽相變溫度(A thermallyresponsive b1polymer for intra-articular drug delivery.Journal of ControlledRelease 2006，115:175 - 182)，即:測(cè)定10°C到95°C類彈性蛋白多肽s的PBS溶液，在波長為350 nm處，類彈性蛋白多肽溶液的濃度用溫度控制的UV-Vis分光光度計(jì)測(cè)定，升溫速率為1°C /min。相變溫度定義為在0D350的最大值的一半所對(duì)應(yīng)的溫度。
[0021]4.類彈性蛋白多肽凝膠黏度測(cè)定:將試樣倒入帶恒溫夾套的樣品筒中.待恒溫至所需溫度(37°C)后，測(cè)定試樣的黏度。每個(gè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次以上測(cè)定結(jié)果的平均值。對(duì)不同條件下(不同氨基酸組成，溫度，濃度，反應(yīng)時(shí)間等的)類彈性蛋白多肽所形成的溶膠或凝膠，通過流變曲線將不同轉(zhuǎn)子及轉(zhuǎn)速下的測(cè)定值換算成同一轉(zhuǎn)子和轉(zhuǎn)速下的相當(dāng)值，以便比較。用黏度評(píng)價(jià)不同條件下的類彈性蛋白多肽凝固和交聯(lián)速度和穩(wěn)固性，探討最佳的氨基