腦膜炎球菌血清組x偶聯(lián)物的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年5月22日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/650,025 ;2012年9月 9日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/698,677 ;以及2013年3月15日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?61/799,528的權(quán)益。前述的申請(qǐng)通過(guò)引用全文納入本文用于所有目的。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及細(xì)菌莢膜糖的領(lǐng)域，具體是腦膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis)血清組X莢膜多糖。該多糖可與載體偶聯(lián)以形成偶聯(lián)物。多糖和偶聯(lián)物可 用于免疫，尤其是在水性制劑中。
【背景技術(shù)】
[0004] 在抵御有莢膜細(xì)菌的疫苗中使用細(xì)菌的莢膜糖已有多年歷史。然而，由于糖是T 非依賴(lài)性抗原，它們的免疫原性較弱。與載體偶聯(lián)可將T非依賴(lài)性抗原轉(zhuǎn)化成T依賴(lài)性抗 原，從而增強(qiáng)記憶反應(yīng)并能發(fā)展出保護(hù)性免疫。因此，最有效的糖疫苗基于糖偶聯(lián)物，原型 偶聯(lián)疫苗針對(duì)流感嗜血菌（Haemophilus influenzae) ( 'Hib'）[例如見(jiàn)參考文獻(xiàn)86的第 14 章]。
[0005] 基于生物體的莢膜多糖，已經(jīng)鑒定了腦膜炎奈瑟球菌的12種血清組（A、B、C、H、 I、K、L、29E、W135、X、Y和Z)。組A是非洲撒哈拉沙漠以南地區(qū)流行疾病中最常涉及的病原 體。血清組B和C是美國(guó)和大多數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家中的大多數(shù)病例的病因。血清組W135和Y是 美國(guó)和發(fā)達(dá)國(guó)家中剩余病例的病因。多年來(lái)已知來(lái)自血清組A、C、Y和W135的莢膜多糖的 四價(jià)疫苗[1，2]。雖然在兒童和成人中有效，但是因?yàn)槎嗵鞘钦T導(dǎo)不能加強(qiáng)的弱免疫應(yīng)答的 非T細(xì)胞依賴(lài)性抗原，其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答弱且保護(hù)持續(xù)時(shí)間短，并且不能用于嬰兒[例如參 考文獻(xiàn)3]。該疫苗中的多糖不是偶聯(lián)的[4]。針對(duì)血清組C的偶聯(lián)疫苗已被批準(zhǔn)用于人， 并且其包括Menjugate?[5]、Meningitec?和NeisVac-C ?。來(lái)自血清組A+C的偶聯(lián)物的混 合物是已知的[6-8]并且已經(jīng)報(bào)道了來(lái)自血清組A+C+W135+Y的偶聯(lián)物的混合物[9-13]。
[0006] 自20世紀(jì)70年代以來(lái)，已知組X莢膜多糖的結(jié)構(gòu)[14]并且該血清組與腦膜炎疾 病的多次爆發(fā)相關(guān)，例如，在非洲撒哈拉沙漠以南地區(qū)和中國(guó)[15，16]。在5歲以下的兒童 中，血清組X已知具有比血清組A明顯高的攻擊率。雖然多年來(lái)已經(jīng)認(rèn)識(shí)到需要針對(duì)這種 血清組的疫苗[17]，但是還沒(méi)有開(kāi)發(fā)出有效的疫苗。已經(jīng)提出了針對(duì)血清組X的偶聯(lián)物疫 苗[17,18]，但是這類(lèi)偶聯(lián)物是否針對(duì)該血清組有免疫原性或保護(hù)性還是未知的。
[0007] 因此，仍然存在對(duì)血清組X莢膜多糖偶聯(lián)物的需求。此外，仍然存在對(duì)可用于針對(duì) 由該血清組造成的疾病的疫苗接種的偶聯(lián)物的需求。
[0008] 組X莢膜多糖的結(jié)構(gòu)由通過(guò)不含0-乙?；摩?1-4磷酸二酯鍵[19]結(jié)合在一起 的N-乙酰葡糖胺-4-磷酸殘基組成：- 4) -D-GlcpNAc- α - (1 - 0Ρ03 - }(圖1)?；谟?它們的結(jié)構(gòu)相似性，已經(jīng)假定MenA和MenX莢膜多糖之間的生物合成關(guān)系[14]。MenA莢膜 多糖易于在水性溶液中發(fā)生明顯水解[20]。這種不穩(wěn)定性被認(rèn)為是由于涉及異頭位的磷酸 二酯連接和甘露糖胺2位中的N-乙?；拇嬖诙斐傻模淇捎兄诹姿釂熙セ鶊F(tuán)的離開(kāi)
[21]。另一種可能性是N-乙酰甘露糖胺亞基的4位上的羥基與磷酸二酯基團(tuán)相互作用通 過(guò)內(nèi)部參與機(jī)制促進(jìn)水解，如在6A型肺炎鏈球菌[22]和B型流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae type b) [23]的莢膜多糖中所見(jiàn)。在MenX和MenA莢膜多糖的結(jié)構(gòu)中的相似 性，尤其是它們共有的異頭磷酸二酯連接，表示在水性溶液中時(shí)，MenX多糖可能存在相似的 穩(wěn)定性問(wèn)題。MenA莢膜多糖在水溶液中的固有不穩(wěn)定性表明當(dāng)包含于疫苗（例如，在多糖 疫苗Mencevax?和偶聯(lián)物疫苗MenAfriVac ?、Menveo?和Nimenrix ?)中時(shí)，其通常以凍干 形式存在。雖然MenX莢膜多糖可以相似地以凍干形式存在以改善其穩(wěn)定性，但是水性制劑 是更為方便的。在水性制劑中含有MenA莢膜多糖偶聯(lián)物的僅有的疫苗是Menactra?，但是 這種疫苗需要在低溫下儲(chǔ)存。這種低溫儲(chǔ)存是昂貴的并且在MenA和MenX時(shí)常爆發(fā)的許多 國(guó)家（例如，非洲撒哈拉沙漠以南地區(qū)）中存在實(shí)際困難。
[0009] 因此，存在對(duì)血清組X莢膜多糖及其偶聯(lián)物的水性制劑的需求，尤其是無(wú)需冷藏 的水性制劑。
[0010] 針對(duì)MenX的疫苗的開(kāi)發(fā)需要用于多糖定量的方法，其可用作加工中測(cè)試和/或用 于最終疫苗的表征。在MenX莢膜多糖中磷酸基團(tuán)的存在表示可通過(guò)測(cè)量總磷含量的比色 法來(lái)定量多糖[24]。然而，這種方法缺少選擇性并且因此不適于某些加工中應(yīng)用，例如，磷 酸鹽緩沖液中或在含磷酸鹽雜質(zhì)存在下的多糖分析。更有選擇性的方法是NMR，其已經(jīng)被 提出用于MenX多糖定量[25]。然而，這種方法要求純的樣品和大量的材料。參考文獻(xiàn)26 證明了替代的方法，其中通過(guò)HPAEC-PAD來(lái)對(duì)MenX多糖進(jìn)行定量，其比NMR更靈敏并且比 測(cè)量磷酸含量更有選擇性。參考文獻(xiàn)26的作者通過(guò)水解樣品生成葡糖胺，并且將釋放的葡 糖胺的量與衍生自N-乙?；?葡糖胺-6-磷酸的定量標(biāo)準(zhǔn)物的校準(zhǔn)曲線做比較來(lái)對(duì)MenX 多糖進(jìn)行定量。然而，由于污染，可能存在葡糖胺，其產(chǎn)生不精確的結(jié)果。因此，存在對(duì)測(cè)量 MenX多糖的替代或改良方法，并且尤其是對(duì)MenX更有選擇性的方法的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明部分基于用于將血清組X莢膜多糖偶聯(lián)至載體分子的方法。本發(fā)明的發(fā)明 人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，所得的偶聯(lián)物是免疫原性的并且能夠誘導(dǎo)殺菌抗體應(yīng)答。因此，血清組X偶聯(lián) 物可用于免疫原性組合物，并且尤其是用于疫苗。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，能夠?qū)⒀褰M X莢膜多糖抗原，例如，血清組X偶聯(lián)物與其他抗原結(jié)合而不失去針對(duì)血清組X的免疫應(yīng)答。 具體地，血清組X偶聯(lián)物可與其他偶聯(lián)物組合，例如包含其他細(xì)菌莢膜糖抗原的偶聯(lián)物。血 清組X偶聯(lián)物特別適于與包含來(lái)自其他腦膜炎奈瑟球菌血清組（例如，血清組A、C、W135和 Y)的莢膜糖抗原的偶聯(lián)物組合。在這些組合中，不僅血清組X偶聯(lián)物保持其免疫原性，血清 組A、C、W135和/或Y偶聯(lián)物也保持其免疫原性。此外，本發(fā)明的發(fā)明人也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)盡管 其與血清組A莢膜多糖在結(jié)構(gòu)上相似，來(lái)自血清組X的莢膜多糖令人驚訝地在溶液中穩(wěn)定。 因此，血清組X莢膜多糖及其偶聯(lián)物特別適用于水性制劑。
[0012] 在第一方面，本發(fā)明提供了腦膜炎奈瑟球菌血清組X莢膜多糖和載體分子的偶聯(lián) 物。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可使用下述的本發(fā)明的第二方面的第一實(shí)施方式的過(guò)程來(lái)制 備血清組X莢膜多糖和載體分子的特別穩(wěn)定的偶聯(lián)物。例如，在37°C下28天后，偶聯(lián)物可 含有低于50%的游離糖?？扇缦挛姆€(wěn)定性研宄（2)所述測(cè)定游離的糖％。因此，在本發(fā)明 的第一方面內(nèi)，本發(fā)明提供了在37°C下28天后包含低于50%的游離的糖的血清組X莢膜 多糖和載體分子的偶聯(lián)物。偶聯(lián)物可具體包含低于25%的游離的糖，尤其是低于20%的游 離的糖并且更具體地低于15%的游離的糖，例如，約10%的游離的糖。
[0013] 在第二方面，本發(fā)明提供了用于制備血清組X莢膜多糖和載體分子的偶聯(lián)物的方 法，尤其是下述第一、第二和第三實(shí)施方式的方法。第二方面也提供了下述的第四實(shí)施方式 的方法。通常通過(guò)這些方法之一得到或可得到本發(fā)明的第一方面的偶聯(lián)物。然而，可通過(guò) 任意合適的方法替代性地制備第一方面的偶聯(lián)物。當(dāng)通過(guò)這些其他方法之一制備本發(fā)明的 偶聯(lián)物時(shí)，該方法通常不包括以下步驟中的一個(gè)或兩個(gè)：a)將多糖與接頭偶聯(lián)，以形成多 糖-接頭中間體，其中接頭的游離末端是酯基團(tuán)，尤其是其中偶聯(lián)間接地發(fā)生，即采用額外 的接頭，該接頭用于在偶聯(lián)到接頭上之前對(duì)多糖衍