壁虎蛆蟲(chóng)蛋白質(zhì)在制備抗黑色素瘤藥品中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種壁虎蛆蟲(chóng)蛋白質(zhì)的新用途，尤其是壁虎蛆蟲(chóng)蛋白質(zhì)在制備抗黑色 素瘤藥品中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性黑素瘤是由皮膚和其它器官黑素細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤，皮膚黑素瘤表現(xiàn)為色素性 皮損在數(shù)月或數(shù)年中發(fā)生明顯改變。
[0003] 由于黑色素細(xì)胞起源于神經(jīng)嵴，廣泛分布于皮膚、眼、黏膜表面和神經(jīng)系統(tǒng)等，因 此，惡性黑色素瘤可以在皮膚、口腔、消化道、生殖系統(tǒng)的黏膜、眼球的睫狀體、虹膜、脈絡(luò)膜 以及腦膜等處發(fā)生。
[0004]惡性黑色素瘤大多是由良好黑色素痣轉(zhuǎn)化而來(lái)。環(huán)境因素、遺傳因素、嚴(yán)重的化 學(xué)、光損害及藥物侵蝕都可以引發(fā)生成惡性黑色素瘤。
[0005]治療方案一般采用外科手術(shù)治療、放療、化療、內(nèi)分泌治療、生物治療、生物化學(xué)治 療，中醫(yī)則將病癥分為風(fēng)濕熱毒、外郁肌膚型，肝郁氣虛、瘀毒凝滯型，肝腎陰虛、肌膚失養(yǎng) 型三種類(lèi)型，對(duì)癥治療。
[0006] CN103417953A公開(kāi)了重組靈芝免疫調(diào)劑蛋白（rLZ-8)在制備治療黑色素瘤藥物 中的應(yīng)用。該發(fā)明采用原位瘤和轉(zhuǎn)移瘤實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研宄重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白的抗腫瘤 作用。
[0007] CN102067828A公開(kāi)了人黑色素瘤高轉(zhuǎn)移模型、細(xì)胞亞系以及建立方法和轉(zhuǎn)移的動(dòng) 態(tài)檢測(cè)。該發(fā)明采用肺轉(zhuǎn)移灶在小鼠肺轉(zhuǎn)移用體內(nèi)篩選的方法建立了皮下移植模型及相應(yīng) 的細(xì)胞亞系。
[0008] CN103952367A公開(kāi)了一種發(fā)酵培養(yǎng)基及利用其生產(chǎn)黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA疫 苗pSVK-CAVA的方法。該發(fā)明描述了發(fā)酵培養(yǎng)基的組成，并描述了其生產(chǎn)方法。
[0009] CN102805859A公開(kāi)了作為體內(nèi)造血刺激劑的TAT-H0XB4H重組蛋白質(zhì)及其醫(yī)療組 成物。本發(fā)明涉及一種C-端含有組氨酸標(biāo)記的H0XB4H重組蛋白質(zhì)的制備方法，該重組蛋 白質(zhì)應(yīng)用于增加骨髓內(nèi)以及周邊血液內(nèi)的造血干細(xì)胞的數(shù)量。
[0010] CN102847144A公開(kāi)了一種提高機(jī)體免疫功能的細(xì)胞類(lèi)生物藥物及其制備方法和 應(yīng)用。該發(fā)明表述了以免疫細(xì)胞與特定抗原在培養(yǎng)基中培養(yǎng)并獲得相應(yīng)抗原的特異性免疫 細(xì)胞培養(yǎng)物，然后后處理分離出具有免疫應(yīng)答的細(xì)胞，用于治療和預(yù)防腫瘤及病毒性疾病。
[0011] CN102924578A公開(kāi)了抗腫瘤多肽及其制備方法和抗腫瘤應(yīng)用。該發(fā)明提供了一種 具有抗腫瘤功能的多肽的制備方法，該多肽包括內(nèi)皮抑素N端鋅離子結(jié)合位點(diǎn)的3個(gè)組氨 酸結(jié)構(gòu)，一個(gè)0折疊結(jié)構(gòu)及串聯(lián)的RGD系列。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明的目的是提供一種壁虎蛆蟲(chóng)蛋白質(zhì)在制備抗黑色素瘤藥品中的應(yīng)用，根據(jù) 黑色素瘤的病灶特性及壁虎蛆蟲(chóng)蛋白質(zhì)生物活性特點(diǎn)，兩者相結(jié)合制備的藥劑具有適應(yīng)性 強(qiáng)、療效好的特點(diǎn)。
[0013] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的： (1)將1000 g壁虎蛆蟲(chóng)在常溫膨化裝置（200520108339. X)中常溫條件下膨化粉碎。
[0014] 本步驟中，所述膨化壓力為0? l~5MPa，時(shí)間為10~60min。
[0015] (2)膨化粉碎后的物料加入到膨脹溶劑體系提取裝置（201210179076. 6)中，加入 膨脹溶劑并加壓至2~10MPa，形成膨脹溶劑體系，提取出壁虎蛆蟲(chóng)蛋白質(zhì)粗品。
[0016] 本步驟中，所述膨脹溶劑由l~10Kg液態(tài)二氧化碳、100~500mL甲醇及 100~300gNH 3 ? H2O組成或由l~10Kg液態(tài)二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化銨組 成。
[0017] 本步驟中，所述提取溫度為10~20°C，時(shí)間為10~30min。
[0018] (3)收集含有壁虎蛆蟲(chóng)蛋白質(zhì)粗品的溶液并且用微孔過(guò)濾器過(guò)濾去掉雜質(zhì)。
[0019] 本步驟中，所述微孔過(guò)濾器的孔徑為0. 5~50Mffl。
[0020] (4)用超濾機(jī)超濾處理，收集含有相應(yīng)分子量的壁虎蛆蟲(chóng)蛋白質(zhì)超濾溶液。
[0021] 本步驟中，所述超濾機(jī)的孔徑為50~100nm。
[0022] (5)超濾液溶解在適宜的溶劑中用固相萃取柱分離，收集洗脫成分。
[0023] 本步驟中，所述溶劑為乙腈。
[0024] (6)將洗脫成分溶解在合適的溶劑體系中，用超聲駐波液相制備色譜 (200920274485. 8)分離純化。
[0025] 本步驟中，所述溶劑體系由正丁醇-乙酸乙酯-水(體積比1. 25:3. 75:5)組成或 4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比）組成。
[0026](7)純化后的壁虎蛆蟲(chóng)蛋白質(zhì)用真空冷凍干燥機(jī)制備成凍干蛋白粉。
[0027] 本步驟中，所述真空冷凍干燥溫度為_(kāi)30~50°C、時(shí)間為18~26h。
[0028] (8)賦予不同的藥用輔助材料，可用于制備抗黑色素瘤藥品。
[0029] 本技術(shù)方案中分離的純化壁虎蛆蟲(chóng)蛋白質(zhì)經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳、雙向聚丙烯酰 胺凝膠電泳及瓊脂聚糖免疫電泳譜上測(cè)得非均一蛋白質(zhì)；用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法 及葡聚糖凝膠G-75凝膠過(guò)濾法測(cè)得相對(duì)分子量為10. 9~12. 6KPa;用等電聚焦發(fā)測(cè)定其等 電點(diǎn)為PH8. 8~10. 2;常規(guī)化學(xué)法分析結(jié)果表明其不含糖基；紫外分光光度法測(cè)定純化的壁 虎蛆蟲(chóng)蛋白質(zhì)含量為96. 7%。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限如此，凡是對(duì) 本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵 蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。
[0031] 實(shí)施例1: (1) 將1000 g壁虎蛆蟲(chóng)干燥品裝入常溫膨化裝置（200520108339. X)中，對(duì)膨化裝置內(nèi) 充入二氧化碳?xì)怏w并加壓至0. l~5MPa，時(shí)間10~60min，然后迅速釋放壓力至常壓，壁虎蛆 蟲(chóng)被膨化成粉體； (2) 膨化粉碎后的壁虎蛆蟲(chóng)粉體加入到膨脹溶劑體系提取裝置（201210179076. 6)中， 加入l~10Kg液態(tài)二氧化碳、100~500mL甲醇及100~300gNH3 ? H2O,加壓至2~10MPa，形成膨 脹溶劑體系，保持溫度l〇~20°C，時(shí)間10~30min，壁虎蛆蟲(chóng)粉體中的蛋白質(zhì)溶解，然后降壓 至常壓，生成壁虎蛆蟲(chóng)蛋白質(zhì)粗品與甲醇-NH3 ? H2O的混合液； (3) 收集含有壁虎蛆蟲(chóng)蛋白質(zhì)粗品的溶液，用孔徑0. 5~50Mm的微孔過(guò)濾器過(guò)濾去處固 體雜質(zhì)； (4) 溶液用孔徑50~100nm的超濾機(jī)超濾處理，壓力0. 3~0. 8MPa，溫度為常溫，收集含有 相應(yīng)分子量的壁虎蛆蟲(chóng)蛋白質(zhì)超濾溶液； (5) 超濾溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用50~100%乙腈活化預(yù)處理，加 0. 02~0. 1%三氟乙酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超濾溶液上柱，常溫下用10~80%的 乙腈梯度脫洗，流速l~l〇mL/min，收集相關(guān)梯度的洗脫成分； (6) 將洗脫成分溶解在4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比)溶劑體系中，用超聲駐 波液相制備色譜（200920274485. 8)分離純化，超聲波功率0. 2~3. 0KW，頻率500~1000KHz， 流速50~500mL/min，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)260~280nm ; (7) 純化后的壁虎蛆蟲(chóng)蛋白質(zhì)用真空冷凍干燥機(jī)在溫度-30~501：、時(shí)間18~2611干燥制 備成凍干蛋白粉。
[0032] 實(shí)施例2: (1) 將1000 g壁虎蛆蟲(chóng)干燥品裝入常溫膨化裝置（200520108339. X)中，對(duì)膨化裝置內(nèi) 充入二氧化碳?xì)怏w并加壓至0. l~5MPa，時(shí)間10~60min，然后迅速釋放壓力至常壓，壁虎蛆 蟲(chóng)被膨化成粉體； (2) 膨化粉碎后的壁虎蛆蟲(chóng)粉體加入到膨脹溶劑體系提取裝置（201210179076. 6)中， 加入5Kg液態(tài)二氧化碳、300mL甲醇及200gNH3 ? H2O,加壓至5MPa，形成膨脹溶劑體系，保持 溫度15°C，時(shí)間20min，壁虎蛆蟲(chóng)粉體中的蛋白質(zhì)溶解，然后降壓至常壓，生成壁虎蛆蟲(chóng)蛋 白質(zhì)粗品與甲醇-NH 3 ? H2O的混合液； (3) 收集含有壁虎蛆蟲(chóng)蛋白質(zhì)粗品的溶液，用孔徑30Mm的微孔過(guò)濾器過(guò)濾去處固體雜 質(zhì)； (4) 溶液用孔徑IOOnm的超濾機(jī)超濾處理，壓力0. 5MPa，溫度為常溫，收集含有相應(yīng)分 子量的壁虎蛆蟲(chóng)蛋白質(zhì)超濾溶液； (5) 超濾溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用80%乙腈活化預(yù)處理，加0. 05%三氟乙 酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超濾溶液上柱，常溫下用1〇~80%的乙腈梯度脫洗，流速 5mL/min，收集相關(guān)梯度的洗脫成分； (6) 將洗脫成分溶解在4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比)溶劑體系中，用超聲駐 波液相制備色譜（200920274485. 8)分離純化，超聲波功率I. 0KW，頻率500KHz，流速200mL/ min，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)260nm ; (7) 純化后的壁虎蛆蟲(chóng)蛋白質(zhì)用真空冷凍干燥機(jī)在溫度-30~40°C、時(shí)間20h干燥制備 成凍干蛋白粉。
[0033] 實(shí)施例3: (1) 將1000 g壁虎蛆蟲(chóng)干燥品裝入常溫膨化裝置（200520108339. X)中，對(duì)膨化裝置內(nèi) 充入二氧化碳?xì)怏w并加壓至0. l~5MPa，時(shí)間10~60min，然后迅速釋放壓力至常壓，壁虎蛆 蟲(chóng)被膨化成粉體； (2) 膨化粉碎后的壁虎蛆蟲(chóng)粉體加入到膨脹溶劑體系提取裝置（201210179076. 6)中， 加入l~10Kg液態(tài)二氧化碳、