磷酸酶和張力蛋白同系物(pten)抑制劑組合物,用途以及方法
【專利說明】磷酸酶和張力蛋白同系物（PTEN)抑制劑組合物，用途以及 方法
[0001] 本申請(qǐng)要求于2009年10月16日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/272, 655的優(yōu)先權(quán)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及用于治療與細(xì)胞毒性或刺激毒性應(yīng)激相關(guān)的不同適應(yīng)癥的治療法，它 們的用途以及方法。具體地是肽類以及它們的組合物，它們具有在其中使用的磷酸酶和張 力蛋白同系物（PTEN)抑制活性以及用于治療與細(xì)胞毒性或刺激毒性應(yīng)激相關(guān)適應(yīng)癥的方 法。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 磷酸酶和張力蛋白同系物（PTEN)是據(jù)報(bào)道涉及多種癌類型進(jìn)展的一種腫瘤抑制 因子（Li 等人 1997;Steck等人 1997;Baker2007)。PTEN 是磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K) / AKT途徑的一種負(fù)調(diào)節(jié)物-失去PTEN導(dǎo)致PI3K/AKT信號(hào)級(jí)聯(lián)的活化并且導(dǎo)致增加的細(xì)胞 生長和增殖。PTEN還顯示具有與PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)不相關(guān)的其他功能-例如，在通過與著 絲粒物理地相互作用維持染色體穩(wěn)定性以及控制DNA修復(fù)方面（Shen等人2007)。PTEN已 經(jīng)隱含在多種非癌適應(yīng)癥中，例如中風(fēng)，其中用siRNA下調(diào)PTEN已經(jīng)顯示在轉(zhuǎn)染的神經(jīng)元 中具有抗局部缺血神經(jīng)元損傷的神經(jīng)保護(hù)作用（Ning等人2004)。
[0005] PTEN的定位和降解已經(jīng)顯示涉及翻譯后修飾，特別是泛素化作用（Trotman等人 2007 ;Wang等人2007 ;Wang等人2008)。PTEN主要定位到細(xì)胞質(zhì)中，但是已知一種獨(dú)特集 合的PTEN定位到細(xì)胞核中（綜述見（Lian和Di Cristofano 2005))。當(dāng)PTEN不包含典型 的細(xì)胞核定位信號(hào)時(shí)，它的確包含兩個(gè)PEST結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域通常發(fā)現(xiàn)于靶向用于通過 泛素化作用降解的蛋白中。實(shí)際上，多泛素化作用已經(jīng)顯示主要靶向PTEN用于細(xì)胞降解 (Wang等人2007)，而單泛素化作用主要涉及PTEN核轉(zhuǎn)位（Trotman等人2007)。PTEN蛋白 序列中兩個(gè)特異性泛素化位點(diǎn)（K13和K289)已經(jīng)顯示直接涉及PTEN核轉(zhuǎn)位-這些位點(diǎn)之 一的單泛素化作用顯示足以用于核轉(zhuǎn)位。這兩個(gè)位點(diǎn)之一的突變顯著地抑制了 PTEN的核 轉(zhuǎn)位（Trotman 等人 2007)。
[0006] 尚不清楚的是核轉(zhuǎn)位是否發(fā)生在中樞神經(jīng)細(xì)胞中，并且如果發(fā)生的話，用于PTEN 的這種核轉(zhuǎn)位的機(jī)理是否與至今已經(jīng)試驗(yàn)過的其他細(xì)胞中的相同。
[0007]發(fā)明概述
[0008] 本發(fā)明部分地基于這種出人意料的發(fā)現(xiàn)，即在神經(jīng)元細(xì)胞中PTEN的K13泛素化位 點(diǎn)的突變顯著地降低了 PTEN的核轉(zhuǎn)位，而在相同細(xì)胞中PTEN的K289泛素化位點(diǎn)的突變未 顯著地影響PTEN的核轉(zhuǎn)位。此外，出人意料的是被設(shè)計(jì)成干擾PTEN的K13泛素化位點(diǎn)處 泛素化作用的某些新型肽類：1)在神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物中阻斷了 NMDA-誘導(dǎo)的PTEN核轉(zhuǎn)位； 2)在神經(jīng)元培養(yǎng)物中阻斷了 NMDA誘導(dǎo)的刺激毒性神經(jīng)元損傷；3)在大鼠局部缺血模型中 體內(nèi)地阻斷了 PTEN核轉(zhuǎn)位；4)當(dāng)中風(fēng)后給藥時(shí)，在大鼠局部缺血模型中體內(nèi)地減少了中風(fēng) 相關(guān)梗死區(qū)；5)當(dāng)中風(fēng)后給藥時(shí)，在大鼠局部缺血模型中體內(nèi)地改善了中風(fēng)相關(guān)長期運(yùn)動(dòng) 行為恢復(fù)；6)在ALS的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型中改善了行為結(jié)果；以及7)在大鼠體內(nèi)局部腦缺血 之后促進(jìn)了腦內(nèi)地移植到梗死區(qū)中的iPS-NPC(干細(xì)胞）的存活；而當(dāng)與設(shè)計(jì)成在PTEN的 K289位點(diǎn)處干擾泛素化作用的肽類比較時(shí)，不顯示這類特性。
[0009] 在本發(fā)明的某些方面中，提供了一種分離的多肽組合物，該多肽組合物具有基本 上類似于SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO:6的氨基酸組成。其 中基本上類似是指當(dāng)比較等效區(qū)域時(shí)（即約14個(gè)氨基酸），包括一種序列一致性程度。此 外，基本上類似是指包括保守取代以及修飾的氨基酸，其條件是針對(duì)PTEN K-13在此說明的 PTEN抑制活性或其他活性得以維持。
[0010] 根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，提供了包括SEQ ID NO: 1的一種分離的多肽或包括與SEQ ID NO: 1具有至少90% -致性的8-14個(gè)氨基酸序列的一種多肽，或包括與SEQ ID NO: 1的對(duì)應(yīng) 氨基酸具有至少90% -致性的8-14個(gè)氨基酸序列的一種多肽，其條件是SEQ ID NO: 1的位 置8是賴氨酸（K)，并且其中該多肽具有磷酸酶和張力蛋白同系物（PTEN)抑制活性。分離 的多肽可以進(jìn)一步包括結(jié)合到分離的多肽上的一個(gè)遞送和靶向（dat)部分。該dat部分可 以是選自下面的一項(xiàng)或多項(xiàng)：配體類、受體類、蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域類（PTD)、或抗體類。該dat 部分可以是一種PTD。該分離的多肽可以包括選自SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:6的一種氨基酸序列。該dat部分可以是選自：觸角足同源結(jié)構(gòu)域、白喉毒素易位結(jié)構(gòu) 域、炭疽毒素易位結(jié)構(gòu)域、假單胞菌外毒素a易位結(jié)構(gòu)域、皮抑菌肽s4、hsv_lvp22、pep-1、 tat蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、聚-1-賴氨酸、以及聚-d-賴氨酸。該多肽可以包括SEQ ID NO: 2。 [0011] 根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，提供了包括SEQ ID NO: 1的一種分離的多肽或包括與SEQ ID NO: 1具有至少90% -致性的8-14個(gè)氨基酸序列的一種多肽，或包括與SEQ ID NO: 1的對(duì)應(yīng) 氨基酸具有至少90% -致性的8-14個(gè)氨基酸序列的一種多肽，其條件是SEQ ID NO: 1的位 置8是賴氨酸（K)，并且其中該多肽保護(hù)細(xì)胞免受細(xì)胞毒性應(yīng)激或刺激毒性應(yīng)激。分離的多 肽可以進(jìn)一步包括結(jié)合到分離的多肽上的一個(gè)遞送和靶向（dat)部分。該dat部分可以是 選自下面的一項(xiàng)或多項(xiàng)：配體類、受體類、蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域類（PTD)、或抗體類。該dat部分 可以是一種PTD。該分離的多肽可以包括選自SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:6 的一種氨基酸序列。該dat部分可以是選自：觸角足同源結(jié)構(gòu)域、白喉毒素易位結(jié)構(gòu)域、炭 疽毒素易位結(jié)構(gòu)域、假單胞菌外毒素a易位結(jié)構(gòu)域、皮抑菌肽s4、hsv-lvp22、pep_l、tat蛋 白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、聚-1-賴氨酸、以及聚-d-賴氨酸。該多肽可以包括SEQ ID NO: 2。
[0012] 根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，提供了一種分離的多核苷酸，該多核苷酸包括對(duì)在此所述 多肽進(jìn)行編碼的一種核苷酸序列。該多核苷酸可以編碼包括SEQ ID NO: 1的一種分離的多 肽或包括與SEQ ID NO: 1具有至少90% -致性的8-14個(gè)氨基酸序列的一種多肽，或包括 與SEQ ID NO: 1的對(duì)應(yīng)氨基酸具有至少90% -致性的8-14個(gè)氨基酸序列的一種多肽，其條 件是SEQ ID NO: 1的位置8是賴氨酸（K)，并且其中該多肽具有磷酸酶和張力蛋白同系物 (PTEN)抑制活性。
[0013] 根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，提供了一種組合物，該組合物包括在此所述的一種多肽和 一種載體。該多肽可以包括選自下面一項(xiàng)或多項(xiàng)的一種多肽：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、 SEQ ID N0:5、以及SEQ ID N0:6,或與其基本上類似的一種氨基酸組合物。該載體可以是選 自下組：一種固相支撐體、一種穩(wěn)定劑、一種防腐劑、以及一種藥學(xué)上可接受的載體。
[0014] 根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，提供了在此所述的一種分離的多肽，該多肽已經(jīng)被重組地 生產(chǎn)并且從細(xì)胞中分離。
[0015] 根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，提供了包含一種分離多核苷酸的載體，該多核苷酸包括對(duì) 在此所述多肽進(jìn)行編碼的一種核苷酸序列。該多核苷酸可以編碼包括SEQ ID NO: 1的一種 分離的多肽或包括與SEQ ID NO: 1具有至少90% -致性的8-14個(gè)氨基酸序列的一種多肽， 或包括與SEQ ID NO: 1的對(duì)應(yīng)氨基酸具有至少90% -致性的8-14個(gè)氨基酸序列的一種多 肽，其條件是SEQ ID N0:1的位置8是賴氨酸（K)，并且其中該多肽具有磷酸酶和張力蛋白 同系物（PTEN)抑制活性。
[0016] 根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，提供了包括在此所述的一種多核苷酸或在此所述的一種載 體的一種細(xì)胞，其中該核苷酸可操作地連接到一個(gè)表達(dá)控制序列上。
[0017] 根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，提供了保護(hù)細(xì)胞免受細(xì)胞毒性應(yīng)激或刺激毒性應(yīng)激的一種 方法，該方法包括將選自下面一項(xiàng)或多項(xiàng)的一種多肽遞送到細(xì)胞中：SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:5、以及 SEQ ID N0:6。
[0018] 根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，提供了保護(hù)細(xì)胞免受細(xì)胞毒性應(yīng)激或刺激毒性應(yīng)激的一種 方法，該方法包括（a)將包括如權(quán)利要求13所述多核苷酸的載體遞送到細(xì)胞中；以及（b) 表達(dá)由該載體攜帶的序列。
[0019] 根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，提供了表達(dá)一種多肽的方法，包括：(a)提供對(duì)該多肽進(jìn) 行編碼的一種表達(dá)載體，其中該多肽是選自下面一項(xiàng)或多項(xiàng)：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、 SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6 ;(b)將該載體引入到細(xì)胞中；以及（c)在允許表達(dá)的條件下維 持細(xì)胞。將載體引入到細(xì)胞中可以體內(nèi)進(jìn)行。將載體引入到細(xì)胞中可以離體進(jìn)行。將載體 引入到細(xì)胞中可以體外進(jìn)行。
[0020] 根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，提供了用于治療與細(xì)胞毒性應(yīng)激相關(guān)疾病的一種方法，包 括將一個(gè)生物學(xué)有效量的PTEN抑制劑施用到需要它的受試者體內(nèi)，該抑制劑包括SEQ ID NO: 1的一種分離的多肽，或包括與SEQ ID NO: 1具有至少90% -致性的14個(gè)氨基酸序列 的一種多肽或包括與SEQ ID NO: 1具有至少90% -致性的8-14個(gè)氨基酸序列的一種多肽， 或包括與SEQ ID NO: 1的相應(yīng)氨基酸具有至少90% -致性的8-14個(gè)氨基酸序列的一種多 肽，其條件是SEQ ID NO: 1的位置8是賴氨酸（K)，并且其中該多肽具有磷酸酶以及張力蛋 白同系物（PTEN)抑制活性。該細(xì)胞毒性應(yīng)激可以是刺激毒性應(yīng)激。
[0021] 根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，提供了用于在干細(xì)胞移植之后增強(qiáng)干細(xì)胞存活的一種方 法，包括將一個(gè)生物學(xué)有效量的下面各項(xiàng)施用到需要它的受試者體內(nèi)：包括SEQ ID NO: 1的 一種分離的多肽，或包括與SEQ ID NO: 1具有至少90% -致性的14個(gè)氨基酸序列的一種多 肽或包括與SEQ ID NO: 1具有至少90% -致性的8-14個(gè)氨基酸序列的一種多肽，或包括與 SEQ ID NO: 1的相應(yīng)氨基酸具有至少90% -致性的8-14個(gè)氨基酸序列的一種多肽，其條件 是SEQ ID N0:1的位置8是賴氨酸（K)，并且其中該多肽具有磷酸酶以及張力蛋白同系物 (PTEN)抑制活性。
[0022]