級種子接種于含0. 1%裂解血球全血馬丁肉湯中，置36- 37°C、 100- 120r/min搖床培養(yǎng)24小時，取樣作純粹檢驗，合格后立即置2-8°C保存，使用期應(yīng)不 超過3日。
[0015] 將綠膿桿菌和克雷伯氏菌一級種子接種于普通肉湯培養(yǎng)基中，置36-37°C、100- 120r/min搖床培養(yǎng)24小時，取樣作純粹檢驗，合格后立即置2 - 8°C保存，使用期應(yīng)不超過 3曰。
[0016] 2.制苗用培養(yǎng)基為營養(yǎng)肉湯或馬丁肉湯培養(yǎng)基。
[0017] 3.制苗用菌液制備 (1)菌液培養(yǎng) 將多殺巴氏桿菌二級種子液接種于生物反應(yīng)器中發(fā)酵培養(yǎng)，按培養(yǎng)基量的1% - 2%接 種二級種子液，并按〇. 1%加入裂解血球全血及適量消泡劑，以逐漸增大通氣量的方法，在 36-37°C通氣條件下培養(yǎng)。溶氧為40%-70%，PH值7. 0-7. 2,轉(zhuǎn)數(shù)50-60r/min，培養(yǎng)16- 20小時即可收獲菌液。
[0018] 將綠膿桿菌和克雷伯氏菌二級種子液接種于生物反應(yīng)器中發(fā)酵培養(yǎng)，按培養(yǎng)基量 的1% - 2%接種二級種子液，同時加入適量消泡劑，以逐漸增大通氣量的方法，在36-37°C 通氣條件下培養(yǎng)。溶氧為40%-70%，PH值7. 0 - 7. 2,轉(zhuǎn)數(shù)50-60r/min，培養(yǎng)16 - 20小時 即可收獲菌液。
[0019] (2)純粹檢驗 綠膿桿菌、克雷伯氏菌及多殺巴氏桿菌三種菌液培養(yǎng)完成后，取樣用普通瓊脂或馬丁 瓊脂作純粹檢驗，結(jié)果均應(yīng)純粹。
[0020] (3)活菌計數(shù) 用含0. 1%裂解血球全血及4%健康動物血清的普通瓊脂或馬丁瓊脂平板，分別對綠膿 桿菌、克雷伯氏菌及多殺巴氏桿菌進(jìn)行活菌計數(shù)，計數(shù)結(jié)果作為配苗時的依據(jù)。
[0021] 4?滅活 分別對綠膿桿菌、克雷伯氏菌及多殺巴氏桿菌三種菌液進(jìn)行滅活，按菌液總量的 0. 2% - 0. 4%緩慢加入甲醛溶液，經(jīng)37°C滅活24小時，期間攪拌數(shù)次，然后用普通瓊脂或馬 丁瓊脂作滅活檢查，培養(yǎng)基上應(yīng)無菌生長。
[0022] 5?離心 采用15000- 20000r/min連續(xù)離心機分別對綠膿桿菌、克雷伯氏菌及多殺多殺巴氏桿 菌三種菌液進(jìn)行離心，然后收集離心后的菌泥，用高壓滅菌的PBS進(jìn)行適當(dāng)稀釋，抽樣進(jìn)行 無菌檢驗，結(jié)果均應(yīng)無細(xì)菌生長。
[0023] 6?配苗與分裝 將三種滅活離心后檢驗合格的菌液等量混合，取混合后的菌液再與佐劑混合，同時按 總量的萬分之一加入硫柳汞，充分?jǐn)嚢杌靹颍?. 5%NaHC(yK溶液調(diào)PH值7. 2-7. 4?；旌?均勻，每瓶定量分裝l〇〇ml，密封瓶口，制成水貂綠膿桿菌、克雷伯氏菌和多殺巴氏桿菌三聯(lián) 滅活疫苗（以下簡稱：本發(fā)明疫苗)。
[0024] 7?成品檢驗 物理性狀：本品為均勻混懸液，靜止后，上層為淺紅色的液體，下層為灰白色沉淀，震搖 后呈均勻混懸液。
[0025] 無菌檢驗：按《中華人民共和國獸藥典》（2010年版）附錄42頁進(jìn)行檢驗，無細(xì)菌 生長。
[0026] 安全檢驗：用7-8周齡健康易感水貂10只，各皮下注射疫苗2ml，觀察10日，所 有接種水貂的精神、食欲、體溫、糞便均應(yīng)正常。
[0027] 效力檢驗：用7-8周齡健康易感水貂30只，分兩組，每組15只，其中一組各肌肉 注射本發(fā)明疫苗lml，另一組作對照，在同條件下飼養(yǎng)14日后攻擊強毒。
[0028] 水貂綠膿桿菌：選取免疫組5只水貂和對照組5只水貂，進(jìn)行水貂綠膿桿菌活菌攻 毒，觀察10日，對照組水貂全部死亡，免疫組水貂至少保護4只；或?qū)φ战M水貂死亡4只，免 疫水貂全部保護為合格。檢驗結(jié)果見表1。
[0029] 克雷伯氏菌：選取免疫組5只水貂和對照組5只水貂，進(jìn)行肺炎克雷伯氏菌活菌攻 毒，觀察14日，對照組水貂全部死亡，免疫組水貂至少保護4只；或?qū)φ战M水貂死亡4只，免 疫水貂全部保護為合格。檢驗結(jié)果見表1。
[0030] 多殺巴氏桿菌：選取免疫組5只水貂和對照組5只水貂，進(jìn)行多殺巴氏桿菌活菌攻 毒，觀察14日，對照組水貂全部死亡，免疫組水貂至少保護4只；或?qū)φ战M水貂死亡4只，免 疫水貂全部保護為合格。檢驗結(jié)果見表1。
[0031] 表1本發(fā)明疫苗效力檢驗結(jié)果
【主權(quán)項】
1. 一種水貂綠膿桿菌、克雷伯氏菌、多殺巴氏桿菌三聯(lián)滅活疫苗，其特征在于，該疫苗 由抗原和常規(guī)疫苗佐劑組成，所述抗原包括水貂綠膿桿菌、克雷伯氏菌和多殺巴氏桿菌，其 中，多殺巴氏桿菌的保藏號為：CGMCC No: 10334;保藏時間：2015年Ol月09日；保藏在 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，分類命名為多殺巴氏桿菌 Iimttocida0
2. 如權(quán)利要求1所述的水貂綠膿桿菌、克雷伯氏菌、多殺巴氏桿菌三聯(lián)滅活疫苗，其特 征在于：所述疫苗中水貂綠膿桿菌滅活前的細(xì)菌濃度不少于30億CFU/mL ;克雷伯氏菌滅活 前的細(xì)菌濃度不少于20億CFU/mL ;多殺巴氏桿菌滅活前的細(xì)菌濃度不少于30億CFU/mL。
3. 如權(quán)利要求1所述的水貂綠膿桿菌、克雷伯氏菌、多殺巴氏桿菌三聯(lián)滅活疫苗的制 備方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 將水貂綠膿桿菌、克雷伯氏菌和多殺巴氏桿菌菌株分別培養(yǎng)繁殖其生產(chǎn)用種子，并 進(jìn)行純粹檢驗； 2) 將上述用于生產(chǎn)的水貂綠膿桿菌、克雷伯氏菌和多殺巴氏桿菌種子液分別接種到生 物反應(yīng)器培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵增殖培養(yǎng)，同時，對該產(chǎn)物進(jìn)行純粹檢驗及活菌計數(shù)； 3) 將增殖培養(yǎng)后的三種菌株進(jìn)行滅活，制得滅活抗原液，并對該產(chǎn)物進(jìn)行滅活檢驗和 無菌檢驗； 4) 將滅活后且檢驗合格的滅活抗原液離心處理，15000rpm -20000rpm連續(xù)離心，棄去 上清收集菌泥，并對菌泥按一定比例進(jìn)行稀釋，置2-8°C條件下保存； 5) 將用于生產(chǎn)的水貂綠膿桿菌、克雷伯氏菌和多殺巴氏桿菌三種滅活且處理后的三種 等量抗原與佐劑混合，制備水貂綠膿桿菌、克雷伯氏菌、多殺巴氏桿菌三聯(lián)滅活疫苗，并進(jìn) 行物理性狀檢驗、無菌檢驗、安全檢驗、效力檢驗和甲醛硫柳汞殘余量檢驗； 6) 水貂綠膿桿菌、克雷伯氏菌、多殺巴氏桿菌三聯(lián)滅活疫苗分裝、貯存。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種水貂綠膿桿菌、克雷伯氏菌、巴氏桿菌三聯(lián)滅活疫苗，該疫苗由已滅活的綠膿桿菌、克雷伯氏菌、巴氏桿菌作為抗原組成，可同時預(yù)防水貂的綠膿桿菌病、克雷伯氏菌病和巴氏桿菌病以及三者的混合感染。該疫苗副作用小，協(xié)同增效具有較好的免疫原性及安全性，可達(dá)到一針多防的效果，減化了疫苗接種的免疫程序，提高了保護效率。CGMCC No: 1033420150109
【IPC分類】A61P31-04, A61K39-108, A61K39-104, A61K39-102
【公開號】CN104740622
【申請?zhí)枴緾N201510115965
【發(fā)明人】張中洋, 張國軍, 扈榮良, 吳金, 張守峰, 劉曄, 王宏宇
【申請人】吉林和元生物工程有限公司
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年3月17日