羥基磷灰石/明膠-羧甲基殼聚糖復(fù)合支架及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物材料技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種羥基磷灰石/明膠-羧甲基殼聚糖復(fù)合支架及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]由外傷、腫瘤或先天缺陷等原因引起的骨缺損是骨科臨床常見的難癥之一，在應(yīng)用數(shù)量上骨移植已經(jīng)成為僅次于輸血的人體組織移植。隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展，人們已可以利用自體骨、異體骨和人工骨替代材料治療骨缺損，但這些材料存在著供體不足、免疫排斥、疾病傳播、與宿主骨的機(jī)械性能和形成率不匹配、以及無法降解等不可忽視的問題。組織工程學(xué)為骨缺損修復(fù)提供了嶄新的研宄思路和重要的選擇性策略。
[0003]作為組織工程基本要素之一，支架材料起到至關(guān)重要的作用，是連接種子細(xì)胞和再生組織的橋梁。理想的支架應(yīng)該盡可能模擬被修復(fù)部位的原始狀態(tài)。由于天然骨在微觀上是由輕基磷灰石納米顆粒(nano-hydroxyapatite, n-HA)和膠原纖維在分子水平上均勾有序排列而成的一種具有活性的高度血管化組織，羥基磷灰石/膠原復(fù)合材料在骨組織工程中引起極為廣泛的研宄。Wang等利用微波輔助滴定法將含有磷酸鹽的膠原溶液與氫氧化鈣溶液混合制備出膠原/羥基磷灰石仿生支架，發(fā)現(xiàn)復(fù)合材料中低結(jié)晶度的羥基磷灰石晶粒以膠原為模板原位生成，所得支架具有較高的孔隙率和大的孔徑。Chen等研宄發(fā)現(xiàn)在原位合成過程中加入絲素蛋白可以大幅提高膠原/羥基磷灰石復(fù)合支架的彈性模量，并使其具有良好的生物相容性。雖然膠原能夠?yàn)殁}化組織提供必不可少的三維結(jié)構(gòu)，對(duì)礦物沉積起誘導(dǎo)作用，而且與細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)、表達(dá)均有密切關(guān)系；但是，其存在機(jī)械性能差、價(jià)格昂貴、降解時(shí)間難以控制以及抗原性消除不確定等問題，這些限制了膠原蛋白/羥基磷灰石復(fù)合材料的進(jìn)一步發(fā)展。
[0004]明膠(gelatin, Gel)是膠原部分水解后的變性產(chǎn)物，與膠原相比，具備抗原性低、來源豐富、比表面積高、成本低、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等特點(diǎn)。基于其表面與媒介特性，明膠可通過靜電和疏水作用實(shí)現(xiàn)離子吸附，此外，不同的明膠有不同的等電點(diǎn)，因而可以選擇通過離子的靜電作用綁定蛋白復(fù)合物。近年來，對(duì)于羥基磷灰石/明膠復(fù)合材料的研宄已經(jīng)取得較大進(jìn)展，Mohammad等通過共沉淀法制備出羥基磷灰石/明膠粉體，然后利用冷凍干燥技術(shù)獲得力學(xué)性能優(yōu)良的復(fù)合支架。但是羥基磷灰石/明膠復(fù)合材料可塑性低、彈性模量與人體骨匹配性較差。
[0005]為了完善其性能，許多學(xué)者開始在羥基磷灰石/明膠復(fù)合材料中加入第二種有機(jī)聚合物作為增強(qiáng)相。殼聚糖衍生于甲殼素，是自然界唯一一個(gè)陽(yáng)離子多糖，由于其具有生物相容性、生物可降解性、抗菌性、無細(xì)胞毒性以及優(yōu)異的蛋白親和性，在生物醫(yī)藥尤其是藥物載體方面具有廣闊的應(yīng)用前景。Zahra等通過原位沉淀法制備出羥基磷灰石/明膠_殼聚糖復(fù)合材料，發(fā)現(xiàn)羥基磷灰石通過鈣離子與高分子鏈上的功能鍵之間的相互作用形成晶核，然后原位長(zhǎng)大；他們同時(shí)發(fā)現(xiàn)殼聚糖的加入可以降低羥基磷灰石晶體的晶粒度，從而提高復(fù)合材料的力學(xué)性能。Mohamed等研宄了輕基磷灰石/殼聚糖_明膠復(fù)合材料在模擬體液中的降解性，證明該材料具有良好的降解性和骨誘導(dǎo)作用，可用作骨組織修復(fù)材料。中國(guó)專利CN1326574C “納米羥基磷灰石/殼聚糖/明膠多孔支架材料及其制備方法”通過相分離技術(shù)制備了殼聚糖/明膠支架，然后將其交替浸泡在鈣鹽和磷酸鹽溶液中獲得復(fù)合支架材料。中國(guó)專利CNlO 140196IB“明膠-殼聚糖-羥基磷灰石球形多孔顆粒材料的制備方法”提供了一種制備具有均一分布顆粒直徑的球形多孔顆粒材料及其制備方法和裝置，依據(jù)該專利獲得的明膠-殼聚糖-羥基磷灰石球形多孔顆粒材料填充后有利于組織液的流動(dòng)和細(xì)胞的迀移生長(zhǎng)。然而，除稀鹽酸、稀醋酸等水溶液外，殼聚糖不溶于水和有機(jī)溶劑；同時(shí)前期研宄表明殼聚糖用于支架材料時(shí)，其降解速率與再生組織的生長(zhǎng)率匹配度較低且降解產(chǎn)物在人體內(nèi)不易吸收。因此，有必要對(duì)殼聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，從而改善其溶解性能，擴(kuò)寬其應(yīng)用范圍。羧甲基殼聚糖(carboxymethyl chitosan, CMCS)是利用羧甲基化作用在殼聚糖鏈上引入了羧甲基后的產(chǎn)物，是一種水溶性殼聚糖，它既保留了殼聚糖的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又極大改善了其水溶性。另外，羧甲基殼聚糖是一種兩性聚電解質(zhì)，與殼聚糖相比其不僅含有氨基、羥基等基團(tuán)，此外其分子鏈上還增加了羧基，因此有利于增加與其他分子通過氫鍵、靜電引力等形成多重相互作用的分子識(shí)別位點(diǎn)。前期研宄表明羧甲基殼聚糖抗菌性更強(qiáng)，是一種良好的組織工程和藥物緩釋材料，但是將羧甲基殼聚糖與羥基磷灰石及明膠復(fù)合制備組織工程支架材料的研宄目前尚未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種羥基磷灰石/明膠-羧甲基殼聚糖復(fù)合支架，該支架材料中，弱結(jié)晶的納米羥基磷灰石均勻分散在有機(jī)高分子網(wǎng)絡(luò)中，形成具有較高強(qiáng)度的聯(lián)通的多孔結(jié)構(gòu)，其形貌與細(xì)胞外基質(zhì)相似，利于細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)；同時(shí)，其降解速度與孔隙率可調(diào)，使得該材料適合用作骨修復(fù)材料。
[0007]本發(fā)明還提供了一種羥基磷灰石/明膠-羧甲基殼聚糖復(fù)合支架的制備方法。
[0008]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0009]一種羥基磷灰石/明膠-羧甲基殼聚糖復(fù)合支架，由羥基磷灰石、明膠、羧甲基殼聚糖構(gòu)成，其中，羥基磷灰石、明膠、羧甲基殼聚糖的質(zhì)量比為(60?80): (10?20):(10 ?20)。
[0010]上述復(fù)合支架的制備方法，包括以下步驟:
[0011]I)將四水硝酸媽溶于水，將四水硝酸媽溶于水，得到濃度為0.2?3mol/L的水溶液，記為溶液a ；
[0012]2)稱取明膠和羧甲基殼聚糖，將其加入到溶液a，500?100rmp下攪拌20?40min，得到溶液b，其中明膠和羧甲基殼聚糖的質(zhì)量比為(I?5):1 ；
[0013]3)配制磷酸氫二銨溶液；
[0014]4)將溶液b置于水浴加熱攪拌裝置中，在20?90°C不斷攪拌，將步驟3)制備的磷酸氫二銨溶液逐滴加入，其中，溶液b中Ca離子與所加入磷酸氫二銨溶液中P離子的摩爾比為1.67，滴加完畢后，繼續(xù)攪拌0.5?2h，反應(yīng)過程中調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值為8?12 ;
[0015]5)將步驟4)得到的混合溶液于110?180°C水熱反應(yīng)0.5?6h ;反應(yīng)結(jié)束后，用去離子水洗滌至中性后再用無水乙醇洗滌、干燥，得到羥基磷灰石/明膠-羧甲基殼聚糖復(fù)合粉體；
[0016]6)將上述羥基磷灰石/明膠-羧甲基殼聚糖復(fù)合粉體加入到無水乙醇中，500?100rmp攪拌0.5?2h，得到羥基磷灰石/明膠-羧甲基殼聚糖復(fù)合膠體，其中羥基磷灰石/明膠-羧甲基殼聚糖復(fù)合粉體與無水乙醇的質(zhì)量比為1:(1?3);
[0017]7)將氯化鈉顆粒以及京尼平加入到上述復(fù)合溶膠中，攪拌、注模，室溫靜置2?4h，其中羥基磷灰石/明膠-羧甲基殼聚糖復(fù)合粉體與氯化鈉的質(zhì)量比為1: (0.1?2)，羥基磷灰石/明膠-羧甲基殼聚糖復(fù)合粉體與京尼平的質(zhì)量比為1: (0.01?0.1);然后_80°C預(yù)凍10?24h，-53°C冷凍干燥15?24h，得到羥基磷灰石/明膠-羧甲基殼聚糖復(fù)合材料；
[0018]8)將所得羥基磷灰石/明膠-羧甲基殼聚糖復(fù)合材料脫模后，室溫下將其置于去離子水中浸泡2?6h，然后冷凍干燥；重復(fù)該步驟3?5次，將氯化鈉顆粒瀝濾干凈，即可得到羥基磷灰石/明膠-羧甲基殼聚糖復(fù)合支架材料。
[0019]步驟3)中，所述磷酸氫二銨的摩爾濃度為0.1?1.5mol/L?
[0020]步驟4中pH值的調(diào)節(jié)通過氨水來調(diào)節(jié)，其中氨水的質(zhì)量濃度為2%?15%。
[0021]步驟7)中氯化鈉顆粒的粒徑為150?500 μ m。
[0022]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明從仿生角度出發(fā)，依據(jù)天然骨的主要成分是羥基磷灰石、膠原蛋白和糖類，利用羥基磷灰石、明膠及羧甲基殼聚糖各自的優(yōu)點(diǎn)，制備一種新型的骨組織修復(fù)材料。本發(fā)明模仿骨形成過程中無機(jī)相在有機(jī)基質(zhì)大分子調(diào)控下的原位析晶過程，采用原位水熱法制備羥基磷灰石/明膠-羧甲基殼聚糖復(fù)合粉體。制備過程中羧甲基殼聚糖與明膠可通過靜電絡(luò)合作用，預(yù)組裝成有機(jī)模板，然后利用二者的極性官能團(tuán)通過離子配位和