虎紋捕鳥蛛毒素-iv變體及其使用方法
【專利說明】
[0001] 早前申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2013年3月14日提交的美國臨時申請61/781，276和2013年3月15 日提交的美國專利申請13/833,555的權(quán)益，所述2篇申請要求2012年9月18日提交的美 國臨時申請61/702,538和2012年5月18日提交的美國臨時申請61/648, 871的權(quán)益，它 們的整個內(nèi)容通過引用并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及虎紋捕鳥蛛毒素-IV變體、編碼它們的多核苷酸、制備和使用前述物 質(zhì)的方法、以及用NavL 7的肽抑制劑減輕疼痛的方法。
【背景技術(shù)】
[0004] 電壓門控鈉通道（VGSC)存在于所有可興奮細(xì)胞（包括心肌細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞以 及中樞神經(jīng)元和周圍神經(jīng)元）中。在神經(jīng)元細(xì)胞中，鈉通道負(fù)責(zé)放大閾下去極化和產(chǎn)生動 作電位的快速上升。這樣，鈉通道是神經(jīng)系統(tǒng)中的電信號的開始和傳播所必需的。認(rèn)為異 常鈉通道功能是多種醫(yī)學(xué)病癥的基礎(chǔ)（HUbner和Jentsch，Hum Mol Genet 11:2435-45， 2002)，所述醫(yī)學(xué)病癥包括癲癇（Yogeeswari 等人，Curr Drug Targets 5:589-602, 2004)、 心律失常（Tfelt-Hansen 等人，J Cardiovasc Electrophysiol 21:107-15, 2010)、肌強 直（Cannon 和 Bean，J Clin Invest 120:80-3, 2010)和疼痛（Cregg 等人，JPhysiol 588: 1897-904,2010)。鈉通道通常是多個亞基的復(fù)合物，基本亞基是成孔α-亞基，其單獨足以 起作用。
[0005] 在人類中存在電壓門控鈉通道（VGSC) α亞基家族的9個已知成員： Navi. I-NavL 9。Navi. X亞家族可以在藥理學(xué)上細(xì)分成河豚毒素（TTX)-敏感的或TTX-抗 性的。NavL 7(也被稱作ΡΝ1、SCN9A或hNE)是TTX-敏感的，并且主要在周圍交感神經(jīng)元 和感覺神經(jīng)元中表達(dá)。NavL 7聚集在神經(jīng)纖維末梢，并放大小閾下去極化和充當(dāng)調(diào)節(jié)興奮 性的閾通道。
[0006] NavL 7功能涉及不同的疼痛狀態(tài)，包括急性疼痛、炎癥性疼痛和/或神經(jīng)性疼 痛。在人類中，已經(jīng)將NavL 7的功能突變的獲得與原發(fā)性紅斑性肢痛癥（PE，一種以灼痛 和四肢炎癥為特征的疾?。╕ang等人，J Med Genet 41 :171-4, 2004)和陣發(fā)性極度疼痛 障礙（PEPD) (Fertleman等人，Neuron 52 :767_74, 2006)相關(guān)聯(lián)。與該觀察結(jié)果相一致， 非選擇性的鈉通道阻滯劑利多卡因、美西律和卡馬西平可以在這些疼痛障礙中提供癥狀緩 解（Legroux-Crespel 等人，Ann Dermatol Venereol 130 :429_33, 2003 ;Fertleman 等人， Neuron 52 :767-74,2006)〇
[0007] SNC9A在人類中的功能缺失突變會造成先天性無痛覺癥（CIP)，即以對疼痛刺激 的完全淡漠或不敏感性為特征的罕見常染色體隱性障礙（Cox等人，Nature 444:894-8， 2006 ;Goldberg 等人，Clin Genet 71 :311_9, 2007 ;Ahmad 等人，Hum Mol Genet 16 : 2114-21,2007)〇
[0008] 已經(jīng)將SCN9A的編碼區(qū)中的單核苷酸多態(tài)性與增加的傷害感受器興奮性和疼痛 敏感性相聯(lián)系。例如，已經(jīng)將導(dǎo)致人NavL 7中的R1150W置換的多態(tài)性rs6746030與骨關(guān) 節(jié)炎疼痛、腰椎間盤切除術(shù)疼痛、幻痛和胰腺炎疼痛相聯(lián)系（Reimann等人，Proc Natl Acad 3(^^4 107:5148-53,2010)。表達(dá)1?11501恥￥1.7的01?神經(jīng)元響應(yīng)于去極化而表現(xiàn)出 增加的發(fā)射頻率（Estacion等人，Ann Neurol 66:862-6, 2009)。已經(jīng)將殘廢形式的纖維 肌痛與SCN9A鈉通道多態(tài)性rs6754031相聯(lián)系，從而指示一些具有嚴(yán)重纖維肌痛的患者可 能具有背根神經(jīng)節(jié)鈉通道?。╒argas-Alarcon 等人，BMC Musculoskelet Disord 13 :23， 2012)〇
[0009] 在小鼠中，SCN9A基因在感受傷害的神經(jīng)元中的缺失會導(dǎo)致機械痛閾和熱痛閾 的下降以及炎癥性疼痛應(yīng)答的減少或消失（Nassar等人，Proc Natl Acad Sci USA 101: 12706-11,2004)。除去所有感覺神經(jīng)元中的NavL 7基因表達(dá)會消除機械疼痛、炎癥性疼 痛和對熱的反射縮回應(yīng)答。刪除感覺神經(jīng)元和交感神經(jīng)元中的SCN9A會消除機械疼痛、 熱疼痛和神經(jīng)性疼痛，并重現(xiàn)在具有SCN9A功能缺失突變的人類中觀察到的無疼痛表型 (Minett等人，Nat Commun 3 :791，2012)。因此，NavL 7抑制劑或阻滯劑可以用于治療寬 范圍的與不同障礙有關(guān)的疼痛。
[0010] 已知蜘蛛毒素含有大量鈉通道阻滯肽，包括虎紋捕鳥蛛毒素-IV(HwTx-IV) (Peng 等人，J Biol Chem 277 :47564-71，2002)、原毒素-1、原毒素-II(Middleton 等人， Biochemistry 41 :14734_47, 2002)和 Phrixotoxin-III (Bosnians 等人，Mol Pharmacol 69 :419_29,2006)。得自中國捕鳥蛛虎紋捕鳥蛛（Ornithoctonus huwena)的虎紋捕鳥蛛 毒素 -IV (HWTx-IV)是NavL 7和其它TTX-敏感的電壓門控鈉通道的有效阻滯劑，且可能通 過將結(jié)構(gòu)域Π 的電壓傳感器引導(dǎo)成向內(nèi)封閉構(gòu)象而充當(dāng)門控修飾劑（Xiao等人，J Biol Chem 283 :27300-13, 2008)。由于它的有利效能和選擇性譜，原毒素-II已經(jīng)成為多個目的 在于證實鎮(zhèn)痛的體內(nèi)研宄的主題，它們都沒有報道在不破壞神經(jīng)束膜的情況下的成功。僅 僅通過皮膚神經(jīng)的脫鞘（Schmalhofer等人，Mol Pharm 74:1476-1484, 2008)或高滲鹽水 的神經(jīng)束膜注射（其導(dǎo)致緊密連接蛋白封閉蛋白-1的減量調(diào)節(jié)）（Hackel等人，PNAS 109 : 29E2018-27, 2012)而實現(xiàn)的血液-神經(jīng)屏障的顛覆是關(guān)于原毒素-II觀察到的任何功效。 需要鑒別用于治療寬范圍的疼痛適應(yīng)癥的其它NavL 7阻滯劑。具體地，需要對NavL 7具 有勝過其它VGSC異形體的選擇性的新型NavL 7阻滯劑。
【附圖說明】
[0011] 圖la)和b)顯示了對于制備的具有在指定殘基位置處的特定置換的虎紋捕鳥蛛 毒素-IV變體而言，NavL 7對藜蘆定誘導(dǎo)的膜去極化的抑制的IC5tl值。參考虎紋捕鳥蛛毒 素-IV殘基對應(yīng)于SEQ ID NO :267的多肽中的殘基。以灰色突出顯示的置換產(chǎn)生了具有 < 300 X KT9M的IC5tl值的變體。以>開始的值指示，特定變體在指定的濃度是無活性的。
[0012] 圖2a)和b)顯示了對于制備的具有在指定殘基位置處的特定置換的虎紋捕鳥蛛 毒素-IV變體而言，NavL 2對藜蘆定誘導(dǎo)的膜去極化的抑制的IC5tl值。參考虎紋捕鳥蛛毒 素-IV殘基對應(yīng)于SEQ ID NO :267的多肽中的殘基。以>開始的值指示，特定變體在指定 的濃度是無活性的。
[0013] 圖3a)和b)顯示了對于每種具有在指定殘基位置處的特定置換的變體而言，制備 的虎紋捕鳥蛛毒素-IV變體的選擇性，表示為Navi. 2的IC5tl值與Navi. 7的IC 5(|值的比率 (關(guān)于藜蘆定誘導(dǎo)的膜去極化的抑制，計算IC5tl值）。參考虎紋捕鳥蛛毒素-IV殘基對應(yīng) 于SEQ ID NO :267的多肽中的殘基。以灰色突出顯示的置換產(chǎn)生了具有等于或超過5. O的 IC5tl(Navi. 2)/IC5tl(Navi. 7)比率的變體。以>開始的值指示，特定變體在指定的濃度是無 活性的。" Inact"指示，該肽對NavL 7是無活性的。
[0014] 圖4顯示了具有< 300χ10-9Μ的IC5tl (Navi. 7)的虎紋捕鳥蛛毒素-IV變體的序列 (關(guān)于藜蘆定誘導(dǎo)的膜去極化的抑制，計算IC5tl值）。
[0015] 圖5顯示了虎紋捕鳥蛛毒素-IV變體的序列，所述變體對NavL 7的選擇性是對 NavL 2的選擇性的至少5倍，這使用IC5tl (Navi. 2)/IC5tl (Navi. 7)比率來評估，對NavL 2是 無活性的（關(guān)于藜蘆定誘導(dǎo)的膜去極化的抑制，計算IC5tl值）。
[0016] 圖6顯示了選擇的虎紋捕鳥蛛毒素-IV變體在全細(xì)胞膜片箝測定（QPatch)中的 IC5tl值和選擇性。
[0017] 圖7顯示了在大鼠中注射之前（Pre)和在后爪背部注射媒介物（η = 9)或 a) 0. 3nmol、b) 3nmol 或 c) 30nmol 的虎紋捕鳥蛛毒素 IV (η = 9)之后 5、10、20、30、45 和 60 分 鐘，以克（g)為單位的Randall-Selitto爪壓力閾值的線圖。使用具有Bonferroni事后檢 驗的雙因素方差分析，將數(shù)據(jù)表示為平均值土均值標(biāo)準(zhǔn)差。NS =不顯著；** = p < 0. 01 ; *** = P < 0· OOl0
[0018] 圖8顯示了虎紋捕鳥蛛毒素 IV處理的大鼠的克閾值的平均曲線下面積（AUC) (對于每只單獨的虎紋捕鳥蛛毒素 IV處理的大鼠）減去媒介物處理的動物的平均AUC。 使用單因素方差分析，存在顯著的劑量效應(yīng)（P < 〇. 001)，從而證實了劑量依賴性的應(yīng)答。 Bonferroni事后檢驗表明每個劑量組之間的顯著差異，** = p <0· 01 ;*** = p <0· OOl0
[0019] 圖9顯示了不同虎紋捕鳥蛛毒素 -IV丙氨酸突變體，其造成從它們各自的分子動 力學(xué)模擬（各50ns)計算出的每個殘基C-α (CA)原子均方根偏差（RMSD)的平均染色的函 數(shù)（QPatch)的顯著（> IOx)減小。在紅色〇.5人至藍(lán)色2.2A的梯度上，將CA Rmsd染色。 (a)WT(b)F6A、（c)PllA、（d)D14A、（e)L22A、（f)S25A、（g)W30A、（h)K32A 和（i)Y33A 虎紋捕 鳥蛛毒素 -IV突變體。
[0020] 圖10顯示了不同虎紋捕鳥蛛毒素-IV丙氨酸突變體，其似乎造成從它們各自的分 子動力學(xué)模擬（各50ns)計算出的每個殘基CA RMSD的平均染色的函數(shù)（QPatch)的異形體 特異性的變化。在紅色0.5人至藍(lán)色2.2人的梯度上，將〇八冊50染色。（ &)1(184、〇3)1?26八、 (c)K27A〇
[0021] 圖11顯示了重組虎紋捕鳥蛛毒素-IV(SEQ ID NO :1)的NMR溶液結(jié)構(gòu)。NMR結(jié)構(gòu) 揭示了 HwTx-IV中的5個殘基（F6、T28、W30、K32和Y33)，它們形成扭曲的β -折疊（青 色）以產(chǎn)生極性的芳基面部，即虎紋捕鳥蛛毒素-IV和NavL 7之間的假定相互作用表面。
[0022] 圖12顯示了具有入塢的虎紋捕鳥蛛毒素-IV的hNavl. 7的結(jié)構(gòu)域2 (DII)電壓 感知結(jié)構(gòu)域（VSD)的同源性模型?；谠撃Ｐ停⒓y捕鳥蛛毒素-IV入塢在由區(qū)段S1-S2 和S3-S4構(gòu)成的溝中。預(yù)測虎紋捕鳥蛛毒素-IV(SEQ ID N0:1)殘基K32和W30分別與 Navl.7(SEQ ID N0:263)殘基 E811 和 M750 相互作用。
[0023] 圖 13 顯示了 NV1D2168(SEQ ID NO :102)變體的 A)序列和 B)IC5Q值。TETRA : FL1PRK. Tetra ;QP :QPatch〇
[0024] 圖 14 顯示了 NV1D2163 (SEQ ID NO :3)變體的 A)序列和 B) IC5tl值。TETRA : FLIPR* Tetra ;QP :QPatch。
[0025] 圖15顯示，A)3nmol和B)30nmol虎紋捕鳥蛛毒素-IV(HwTx-IV)的局部施用會 在傷害性疼痛的大鼠模型中提供鎮(zhèn)痛作用，如通過HwTx-IV施用以后爪壓力閾值的增加所 測得的。C)在指定濃度時HwTx-IV的爪壓力應(yīng)答的平均曲線下面積（AUC)。在C)中，**p < 0. 01 < 0. 001。
[0026] 圖16顯示，八)0.311111〇1、8)311111〇1、〇3011111〇1原毒素-11(?1'(^1-11)的局部施用會 在傷害性疼痛的大鼠模型中提供鎮(zhèn)痛作用，如通過ProTx-II施用以后爪壓力閾值的增加 所測得的。D)在指定濃度時HwTx-IV的爪壓力應(yīng)答的平均曲線下面積（AUC)。在C)中，*p < 0· 05 ;**p < 0· 01。
[0027] 圖17顯示了在由大鼠中50%大鼠腳底內(nèi)CFA誘導(dǎo)的單關(guān)節(jié)炎的大鼠模型中降低 的A)觸覺痛覺超敏和B)熱痛覺超敏。C)腳底內(nèi)ProTx-II施用會顯著降低完全弗氏佐劑 (CFA)誘導(dǎo)的觸覺痛覺超敏。
[0028] 圖18A) 100 %小鼠腳底內(nèi)CFA誘導(dǎo)了觸覺痛覺超敏，但是50% CFA沒有。B)腳底 內(nèi)ProTx-II施用會顯著降低100% CFA處理的動物中的觸覺痛覺超敏；C)加巴噴丁也降低 觸覺痛覺超敏，盡管在比ProTx-II更低的程度上。
[0029] 圖19顯示了在動物中CFA誘導(dǎo)的炎癥性疼痛的小鼠模型中降低的A)觸覺痛覺 超敏和B)熱痛覺超敏，所述動物用ProTx-II處理，經(jīng)由微型泵以228 μ g/小、鼠/天施用 ProTx-II 持續(xù) 3 天。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0030] 本發(fā)明的一個實施例是分離的虎紋捕鳥蛛毒素-IV變體，其包含序列X1CX 2X3X4FX5 X6CX7X8X9X1(lX nX12CCX13X14X15X 16X17X18CX19X2(lX 21X22X23X24CKX25X 26IX27X28 (SEQ ID N0:265);其中Xp X2、X3、X4、X5、X 6、X7、X8、X9、X10、X n、X12、X13、X14、X15、X 16、X17、X18、X19、X20、X 21、X^、X23、XM、X25 和&6是任意氨基酸；X 27和X 28是任意氨基酸或缺失；且所述虎紋捕鳥蛛毒素-IV變體對人 Navl.7(SEQ ID N0:263)具有約300X10_9M或更低的IC5tl值，前提條件是，所述虎紋捕鳥蛛 毒素-IV變體不是包含SEQ ID NO :1中所示序列的多肽。
[0031] 本發(fā)明的另一個實施例是分離的虎紋捕鳥蛛毒素-IV變體，其包含序列X1CX 2X3X4 FX5X6CX7X8X9X 1(lXnX12CCX13X14X 15X16X17X18CX19X 2(lX21X22X23X24CKX 25X26IX27X28 (SEQ ID N0:265);其中 Xp X2、X3、X4、X5、X6、X 7、X8、X9、X10、Xn、X 12、X13、X14、X15、X16、X 17、X18、X19、X20、X21、X 22、X23、X24、 乂25和X 26是任意氨基酸；X2JP X 28是任意氨基酸或缺失；且所述虎紋捕鳥蛛毒素-IV變體選 擇性地抑制NavL 7,前提條件是，所述虎紋捕鳥蛛毒素-IV變體不是包含SEQ ID NO :1所 示序列的多肽。
[0032] 本發(fā)明的另一個實施例是分離的虎紋捕鳥蛛毒素-IV變體，其包含序列X1CX 2X3X4F X5X6CX 7X8X9X1(lXnX12CCX 13X14X15X16X17X 18CX19X2(lX21TX22WCKYX 23X24X25X26 (SEQ ID N0:276);其中 Xp X2、X3、X4、X5、X 6、X7、X8、X9、X1(l、X n、X12、X13、X14、X15、X 16、X17、X18、X19、X2(l、X 21、X22、X23#P X S4TEy[壬 意氨基酸；&5和乂26是任意氨基酸或缺失；且所述虎紋捕鳥蛛毒素-IV變體對人Navi. 7(SEQ ID NO :263)具有約300X10_9M或更低的IC5tl值，前提條件是，所述虎紋捕鳥蛛毒素-IV變 體不是包含SEQID NO :1中所示序列的多肽。
[0033] 本發(fā)明的另一個實施例是分離的多核苷酸，其編碼本發(fā)明的虎紋捕鳥蛛毒素-IV 變體。
[0034] 本發(fā)明的另-個實施例是載體，其包含本