一種葉酸修飾的磺酸甜菜堿-殼聚糖納米顆粒及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于具有腫瘤靶向作用的納米顆粒制劑領(lǐng)域，具體涉及一種葉酸修飾的磺 酸甜菜堿-殼聚糖納米顆粒及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 化學(xué)治療（chemotherapy)作為癌癥治療的重要手段之一，長(zhǎng)期以來(lái)一直受到高度 關(guān)注。從1946年氮芥的臨床應(yīng)用至今，腫瘤的化療應(yīng)用得到了近70年的發(fā)展。然而，到 目前為止，僅有少部分惡性腫瘤如惡性淋巴瘤、絨毛膜上皮癌等有可能通過(guò)化療得到治愈， 90%以上的惡性腫瘤仍未能達(dá)到滿(mǎn)意的療效。許多抗腫瘤藥物所存在的臨床療效低下、特異 性差、毒副作用大等問(wèn)題已經(jīng)成為癌癥化療中的瓶頸。由于無(wú)法控制抗腫瘤藥物集中于腫 瘤部位，病人的正常組織和器官通常會(huì)受到不必要的傷害，甚至威脅到患者的生命。
[0003] 近年來(lái)，利用納米載體負(fù)載抗腫瘤藥物的方法，不僅可以提高藥物溶解度、增加藥 物穩(wěn)定性以及實(shí)現(xiàn)藥物緩釋?zhuān)€能夠借助其特殊的尺寸范圍和表面性質(zhì)大幅度地改變藥物 在體內(nèi)的分布和代謝狀況，增強(qiáng)藥物對(duì)腫瘤血管壁的滲透并在腫瘤部位富集（EPR效應(yīng))，延 長(zhǎng)藥物在腫瘤部位的作用時(shí)間。此外，經(jīng)靶向分子修飾的納米顆粒可以通過(guò)主動(dòng)靶向提高 腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的攝取，實(shí)現(xiàn)藥物特異性輸送到腫瘤部位，在提高治療效果的同時(shí)減輕對(duì) 其他臟器的傷害，已成為研宄的熱點(diǎn)與重點(diǎn)。
[0004] 葉酸（Folic Acid，F(xiàn)A)是一種小分子水溶性維生素，腫瘤細(xì)胞會(huì)通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸來(lái) 攝取微環(huán)境中的葉酸，以便維持過(guò)度活躍的新陳代謝作用，因此在大部分腫瘤細(xì)胞表面均 存在過(guò)量表達(dá)的葉酸受體，而正常細(xì)胞表面上的葉酸受體表達(dá)量很少。研宄表明，將葉酸分 子連接在納米載體表面，可以提高葉酸受體高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞對(duì)納米載藥體系的吞噬，實(shí) 現(xiàn)納米載體所負(fù)載的抗腫瘤藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向輸送。
[0005] 通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)可以發(fā)現(xiàn)，雖然目前已有多項(xiàng)專(zhuān)利公開(kāi)了以葉酸為靶向分子的 靶向納米藥物載體，但是合成葉酸修飾的磺酸甜菜堿-殼聚糖納米顆粒作為藥物載體用于 抗腫瘤藥物輸送與腫瘤靶向治療的研宄尚未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)上述情況，本發(fā)明的目的在于提供一種葉酸修飾的磺酸甜菜堿-殼聚糖納米 顆粒及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明利用某些腫瘤細(xì)胞表面葉酸受體高表達(dá)這一特點(diǎn)，將其 配體葉酸嫁接在磺酸甜菜堿-殼聚糖上面，合成出一種兩親性納米顆粒。在水溶液中，上述 兩親性納米顆?？梢园恍┦杷孕》肿踊熕幬锶缱仙即?、依托泊苷、他莫昔芬等。相 對(duì)于單純的化療藥物，本發(fā)明的載藥納米顆粒具有良好的藥物緩釋效果以及較高的藥物溶 解度和穩(wěn)定性，可以在血液里發(fā)揮長(zhǎng)循環(huán)作用，而且對(duì)高葉酸受體表達(dá)的腫瘤細(xì)胞具有靶 向性和明顯的抑制效果，可用于癌細(xì)胞的靶向治療。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了 一種葉酸修飾的磺酸甜菜堿-殼聚糖納米 顆粒的制備方法。首先，在大劑量γ射線(xiàn)的照射下，通過(guò)自由基間的聚合反應(yīng)把一個(gè) 含有兩性離子的小分子親水性化合物一一磺酸甜菜堿（SBM)嫁接在殼聚糖表面，這樣 就會(huì)形成一個(gè)兩親性的納米顆粒；然后，在脫水縮合劑（EDC、DCC或DIC)和縮合促進(jìn)劑 (NHS、DMAP或HoBt)的參與下，采用酰胺化反應(yīng)把葉酸（FA)接枝到磺酸甜菜堿-殼聚糖 (Cs-^PSBMA)骨架上，最終得到用于負(fù)載活性藥物的葉酸-磺酸甜菜堿-殼聚糖納米顆粒 (Cs-g+SBMA-FA)，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。
[0008] 具體而言，該制備方法包括如下步驟： 1) 混合溶液的制備：按照葉酸：脫水縮合劑：縮合促進(jìn)劑2:1~1. 2的摩爾比， 將上述反應(yīng)物加入到無(wú)水溶劑中，在室溫條件下攪拌至溶解，得到混合溶液； 2) 葉酸的接枝：按照葉酸中的羧基：殼聚糖中的氨基=1:1的摩爾比，將步驟1)中得 到的混合溶液緩慢加入到磺酸甜菜堿-殼聚糖水溶液中，在室溫、避光條件下攪拌16~24h， 得到葉酸修飾的磺酸甜菜堿-殼聚糖納米顆粒水溶液； 3) 透析和凍干：將步驟2)中得到的葉酸修飾的磺酸甜菜堿-殼聚糖納米顆粒水溶 液置于透析袋中，首先用堿液透析12~18h，再用去離子水透析24~48h，將得到的透析液 在12000~14000rpm下離心40~60min，最后將上清液冷凍干燥，得到葉酸修飾的磺酸甜菜 堿-殼聚糖納米顆粒。
[0009] 優(yōu)選的，步驟1)中所述葉酸、脫水縮合劑、縮合促進(jìn)劑之間的摩爾比為1:1:1。
[0010] 優(yōu)選的，步驟1)中所述脫水縮合劑為碳二亞胺類(lèi)化合物，用于活化羧基，促使酰胺 的生成，其選自N-(3-二甲基氨基丙基）-Ν' -乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC)、Ν，Ν'-二異丙基 碳二亞胺（DIC)、Ν，Ν'-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC)中的任意一種，優(yōu)選Ν-(3-二甲基氨基丙 基）-Ν' -乙基碳二亞胺鹽酸鹽。
[0011] 優(yōu)選的，步驟1)中所述縮合促進(jìn)劑為N-羥基類(lèi)化合物，可以提高酰胺化反應(yīng)的產(chǎn) 率，減少副反應(yīng)的發(fā)生，其選自N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)、1-羥基苯并三氮唑（HOBT)、1-羥 基-7-偶氮苯并三氮唑（HOAT)中的任意一種，優(yōu)選N-羥基琥珀酰亞胺。
[0012] 優(yōu)選的，步驟1)中所述溶劑選自二甲基亞砜（DMS0)、乙醇、甲醇中的任意一種，優(yōu) 選二甲基亞砜。
[0013] 優(yōu)選的，步驟2)中所述磺酸甜菜堿-殼聚糖通過(guò)下法制得：首先，按照1:1:5~6的 重量比，將殼聚糖、磺酸甜菜堿和RAFT試劑溶解在含有1%鹽酸和丙酮的混合溶液中，惰性 氣體除氧后密封，暴露在輻射劑量為IOGy/min的 6tlCo源下反應(yīng)15~20h ;其次，將反應(yīng)物置 于截留分子量為25000Da的透析袋中，用去離子水透析48~72h，得到留在透析袋中的磺酸 甜菜堿-殼聚糖水溶液；最后，將得到的水溶液于_20°C預(yù)凍6~8h，然后冷凍干燥36~48h， 得到兩親性納米顆?；撬崽鸩藟A-殼聚糖； 其中： 所述殼聚糖的脫乙酰度為95. 2%，平均分子量為50000g/m