蛋白液。
[0030] 步驟（4)所述超濾、濃縮、透析包括以下步驟：收集純化后的蛋白液，邊攪拌邊加 入0. 5mol/L鹽酸液，調(diào)整pH至4. 0,用6倍體積的2-8°C注射用水透析，透析至乙醇含量低 于0· 025 % (每100mL含0· 025g酒精），蛋白液濃度3 %以上（每100mL含3g球蛋白），即 得。
[0031] 本發(fā)明所述犬細(xì)小病毒特異性免疫球蛋白制劑能夠應(yīng)用于制備預(yù)防或治療犬細(xì) 小病毒病的藥物或試劑。
[0032] 本發(fā)明犬細(xì)小病毒特異性免疫球蛋白制劑中還可以加入適宜的保護劑，例如麥芽 糖、葡萄糖等。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實際需要對保護劑的用量進行調(diào)整。
[0033] 臨床應(yīng)用結(jié)果表明，對臨床上診斷為犬細(xì)小病毒感染的患病犬靜脈輸注本發(fā)明 優(yōu)化后方法制備的犬細(xì)小病毒特異性免疫球蛋白制劑，并配合使用其他藥物，治愈率高達 94%，而輸注其他方法所制備的免疫球蛋白的治愈率最高僅為79%。
[0034] 本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：
[0035] 本發(fā)明犬細(xì)小病毒特異性免疫球蛋白制劑中，犬細(xì)小病毒特異性免疫球蛋白含量 達到30mg/ml以上，蛋白質(zhì)純度達到97%以上，內(nèi)毒素小于16IU，中和抗體效價不低于1 : 400 ;可應(yīng)用于各品種犬感染細(xì)小病毒時的治療與緊急預(yù)防，增加患病犬機體免疫力和抗病 力。優(yōu)化后的犬細(xì)小病毒特異性免疫球蛋白制劑的制備方法，既保持了免疫球蛋白分子結(jié) 構(gòu)的完整性和特有的生物活性，又提高了蛋白質(zhì)純度、免疫球蛋白含量和生物安全性。
[0036] 本發(fā)明所涉及到的術(shù)語宙義
[0037] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。
[0038] 術(shù)語"內(nèi)毒素"是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種成分，叫做脂多糖。脂多糖對宿 主是有毒性的。內(nèi)毒素只有當(dāng)細(xì)菌死亡溶解或用人工方法破壞菌細(xì)胞后才釋放出來，所以 叫做內(nèi)毒素。其毒性成分主要為類脂質(zhì)A。
[0039] 術(shù)語"中和抗體和中和抗體效價"，中和抗體是當(dāng)病原微生物侵入動物機體時由體 內(nèi)適應(yīng)性免疫應(yīng)答細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一種能與抗原特異性結(jié)合且具有特殊抗病能力的蛋白 質(zhì)，這種蛋白質(zhì)實際就是免疫球蛋白。中和抗體是一種可溶性蛋白，存在于血液、淋巴和組 織液中，當(dāng)病毒等病原微生物侵入體內(nèi)后，免疫細(xì)胞把中和蛋白分泌到血液里，后者與血液 里的病毒等病原微生物顆粒結(jié)合，阻止病毒等病原微生物感染細(xì)胞，破壞病毒等病原微生 物顆粒，這樣就把病毒等病原微生物"中和"掉了。中和抗體效價是用來評價中和抗體中 和病原微生物活性和能力的重要指標(biāo)，一般采用細(xì)胞中和試驗來測定中和抗體的效價，按 reed-muench法計算能夠使50 %細(xì)胞孔獲得保護的最高稀釋度來確定中和抗體的效價。
【附圖說明】
[0040] 圖1為細(xì)胞病變結(jié)果；其中，A為不能完全中和病毒，產(chǎn)生CPE ;B為完全中和，無 CPE產(chǎn)生。
【具體實施方式】
[0041] 下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但是應(yīng)理解所述實施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng) 域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié) 和形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護范圍。
[0042] 實施例1犬細(xì)小病毒特異性免疫球蛋白制劑的制備
[0043] 1、實驗方法
[0044] I. 1高免健康犬血漿或血清的制備
[0045] (1)選取一定數(shù)量的健康肉用犬，接種符合《中國獸藥典》質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求的犬細(xì)小 病毒疫苗，按照使用說明進行操作，2周后同樣方法加強免疫；
[0046] (2)免疫接種完成后10-14天，選取符合下列要求的犬血漿或血清為制造免疫球 蛋白用原料血漿或血清：利用血凝抑制試驗（HI)測定抗體效價，抗體效價不低于I :1280 ;
[0047] (3)頸靜脈采血，混合，低溫保存。
[0048] 1. 2低溫乙醇法提取犬細(xì)小病毒特異性免疫球蛋白
[0049] (1)將上述制備的血漿或血清融化，逐漸降溫至0°C，用pH為4. 0的醋酸緩沖液 調(diào)整pH至7. 5,加入預(yù)冷乙醇（即預(yù)冷為-15°C - -20°C的53. 3%乙醇）至終濃度10% (g/100ml)，轉(zhuǎn)數(shù)14000r/min離心去除雜蛋白，得上清液；
[0050] (2)對上清液進行處理，調(diào)整pH至4. 0,逐漸加入乙醇至終濃度20% (g/100ml)， 靜置過夜后，離心保留沉淀；
[0051] (3)上述沉淀加入10倍體積的(TC注射用水，用0· 5mol/L Na2HPOjP 0· 5mol/L醋 酸調(diào)整pH至5. 5,攪拌4小時，靜置過夜，得溶解液；
[0052] (4)上述溶解液用連續(xù)離心機離心，用0· 45um濾板過濾上清，用0· 5mol/L Na2HPO4 和0. 5mol/L醋酸調(diào)整pH至5. 0,加入乙醇至終濃度20% (g/100ml)，攪拌4小時，靜置過 夜；
[0053] (5)離心分離雜蛋白后的上清液調(diào)pH至6· 0,加入乙醇至終濃度25% (g/100ml)， 靜置過夜得到免疫球蛋白懸浮液，離心，沉淀即為免疫球蛋白。
[0054] I. 3DEAE-Sepharose_FF凝膠柱層析純化免疫球蛋白
[0055] (1)用0· 5mol/L NaOH溶液調(diào)上述蛋白液pH至6. 6 ;
[0056] (2)用磷酸鹽緩沖液平衡凝膠柱；
[0057] (3)上樣蛋白液，待IgG蛋白峰剛出現(xiàn)收集穿透蛋白液；
[0058] (4)上樣完成后用磷酸鹽緩沖液沖洗，待IgG峰下降至最高峰的約2/3處，用醋酸 鹽緩沖液沖洗層析柱，收集蛋白液。
[0059] 1. 4超濾濃縮透析免疫球蛋白
[0060] 超濾濃縮透析包括以下步驟：將收集的層析后蛋白液，邊攪拌邊緩慢加入 0. 5mol/L鹽酸液，調(diào)節(jié)pH至4. 0,用6倍體積的2-8°C注射用水透析，透析至乙醇含量低于 0.025% (每100mL含0.025g酒精），蛋白液濃度3% (每100mL含3g球蛋白）以上，分裝 或凍干保存。
[0061] 1. 5犬細(xì)小病毒特異性免疫球蛋白的蛋白質(zhì)濃度、純度、內(nèi)毒素含量測定
[0062] 按照《中國獸藥典》、《中國藥典》規(guī)定的方法測定所制備的犬細(xì)小病毒特異性免疫 球蛋白的蛋白質(zhì)濃度、純度、內(nèi)毒素含量。
[0063] 2、實驗結(jié)果
[0064] 所制備的犬細(xì)小病毒特異性免疫球蛋白的蛋白質(zhì)濃度為32mg/ml，蛋白質(zhì)純度為 97%，內(nèi)毒素含量小于16IU，pH為4.0。
[0065] 實施例2犬細(xì)小病毒特異性免疫球蛋白制劑的制備
[0066] 1、實驗方法
[0067] 犬細(xì)小病毒特異性免疫球蛋白制劑的制備方法同實施例1，區(qū)別在于，低溫乙醇法 提取犬細(xì)小病毒特異性免疫球蛋白的具體操作如下：
[0068] (1)將制備的血漿或血清融化，逐漸降溫至(TC，調(diào)整pH至7. 8,加入預(yù)冷乙醇（即 預(yù)冷為-15°C - -20°C的53. 3%乙醇）至終濃度12% (g/100ml)，轉(zhuǎn)數(shù)14000r/min離心去 除雜蛋白，得上清液；
[0069] (2)對上清液進行處理，調(diào)整pH至4. 4,逐漸加入乙醇至終濃度25% (g/100ml)， 靜置過夜后，離心保留沉淀；
[0070] (3)上述沉淀加入10倍體積的0°C注射用水，用0· 5mol/L Na2HPO4和0· 5mol/L醋 酸調(diào)整pH至5. 5,攪拌6小時，靜置過夜，得溶解液；
[0071] (4)上述溶解液用連續(xù)離心機離心，用0· 45um濾板過濾上清，用0· 5mol/L Na2HPO4 和0. 5mol/L醋酸調(diào)整pH至5. 5,加入乙醇至終濃度25% (g/100ml)，攪拌5小時，靜置過 夜；
[0072] (5)離心分離雜蛋白后的上清液調(diào)pH至6. 4,加入乙醇至終濃度25% (g/100ml)， 靜置過夜得到免疫球蛋白懸浮液，離心，沉淀即為免疫球蛋白。
[0073] 2、實驗結(jié)果
[0074] 所制備的犬細(xì)小病毒特異性免疫球蛋白的蛋白質(zhì)濃度為19mg/ml，蛋白質(zhì)純度為 92%，內(nèi)毒素含量為64IU，pH為4. 5。
[0075] 實施例3犬細(xì)小病毒特異性免疫球蛋白制劑的制備
[0076] 1、實驗方法
[0077] 犬細(xì)小病毒特異性免疫球蛋白制劑的制備方法同實施例1，區(qū)別在于，低溫乙醇法 提取犬細(xì)小病毒特異性免疫球蛋白的具體操作如下：
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