納米材料的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及功能性Fe3O4納米材料的制備領(lǐng)域，特別是兼有腫瘤雙革El向識別能力和良好的生物相容性的Fe3O4納米材料的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]Fe3O4納米材料以其豐富的物理化學(xué)性質(zhì)、優(yōu)良的磁性質(zhì)和表面易于修飾的特點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于磁共振成像、蛋白分離、藥物輸送、磁熱治療以及光熱治療等領(lǐng)域。由于Fe3O4納米材料可以明顯地縮短周圍水分子的T 2弛豫時(shí)間，并且具有較高的弛豫率，所以該納米材料已經(jīng)成為應(yīng)用最為廣泛的1~2加權(quán)磁共振成像的陰性對比劑，在基礎(chǔ)研宄和臨床疾病診斷中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。
[0003]目前Fe3O4納米材料的制備方法包括共沉淀法、水熱法和熱分解法等。由于配體在納米材料的可控生長、穩(wěn)定性和表面性質(zhì)調(diào)控等方面扮演不可替代的關(guān)鍵角色，因此配體的選擇對于制備性質(zhì)優(yōu)良的納米材料至關(guān)重要。目前可用于制備Fe3O4納米材料的配體包括有機(jī)小分子和葡聚糖、右旋糖酐、聚乙二醇和聚乙烯亞胺等大分子化合物。配體的合理選擇，可以有效的提高Fe3O4納米材料的穩(wěn)定性、溶劑分散性以及成像對比效果。為了將Fe 304納米材料應(yīng)用于腫瘤的特異性診斷，需要將腫瘤靶向分子(葉酸、RGD多肽、轉(zhuǎn)鐵蛋白和透明質(zhì)酸等)再進(jìn)一步修飾在Fe3O4納米材料表面。目前腫瘤革El向Fe 304納米材料的發(fā)展遇到的瓶頸問題主要有:(I)潛在的生物毒性。外源性的配體分子在改善納米材料物理化學(xué)性質(zhì)的同時(shí)，也帶來了潛在的生物安全性的新問題。(2)靶向識別能力差。單靶標(biāo)修飾由于空間位阻以及靶向活性位在后修飾過程中的部分封閉，導(dǎo)致材料靶向識別能力有限。(3)合成步驟相對繁瑣，不利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。以上問題極大限制了其在臨床轉(zhuǎn)化方面的應(yīng)用。因此發(fā)展一種合成步驟簡單、反應(yīng)條件溫和、生物相容性優(yōu)良、強(qiáng)腫瘤靶向能力的Fe3O4納米材料已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)影像前沿領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。
[0004]透明質(zhì)酸是一種酸性粘多糖，是人體許多組織的重要組成部分，如細(xì)胞外基質(zhì)、目艮球玻璃體等。同時(shí)它在細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和損傷修復(fù)中也扮演著重要角色。尤為重要的是，透明質(zhì)酸可以和多種腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的CD44受體特異性結(jié)合，所以它也被人們廣泛用于腫瘤靶向成像和治療領(lǐng)域。轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳鐵蛋白等生物活性蛋白具有良好的生物相容性，同時(shí)和多種惡性腫瘤表面高表達(dá)的受體特異性結(jié)合。由于透明質(zhì)酸和靶向蛋白分子固有的生物安全性和明確的腫瘤靶向性，可以用于制備多功能納米材料的優(yōu)良配體。
[0005]綜上所述，將本身具有腫瘤靶向特點(diǎn)的內(nèi)源性生物大分子作為配體和靶標(biāo)分子來合成和修飾被美國FDA批準(zhǔn)臨床使用的Fe3O4納米材料，將成為構(gòu)建生物相容性良好兼具強(qiáng)腫瘤靶向能力的磁共振靶向成像探針的重要策略。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是為了解決目前腫瘤靶向Fe3O4納米材料存在的潛在生物毒性、較差的靶向識別能力以及相對繁瑣的合成步驟等問題，發(fā)展基于Fe3O4納米材料的新型靶向分子探針，提供一種生物相容性良好的雙靶標(biāo)修飾的Fe3O4納米材料的制備方法。該方法以透明質(zhì)酸和革巴向蛋白分子共同修飾Fe3O4納米材料，具有生物相容性良好和強(qiáng)腫瘤革El向核磁成像能力的特點(diǎn)。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案:
[0008]一種生物相容性良好的雙靶標(biāo)修飾Fe3O4納米材料的制備方法，步驟如下:
[0009]I)在容器中，按照摩爾比 Fe3+: Fe2+ = 2:1 將 FeCl 3.6H20 和 FeCl2.4H20 溶于 H2O 中，機(jī)械攪拌溶解，并通以惰性氣體保護(hù)；之后向上述溶液加入5-10mL質(zhì)量濃度為27% NH4OH,隨后加入5-10mL透明質(zhì)酸水溶液，室溫下繼續(xù)反應(yīng)至少30min ；
[0010]2)將所得透明質(zhì)酸修飾的Fe3O4納米材料利用外加磁場，用高純水清洗，以除去反應(yīng)雜質(zhì)，然后將材料溶于高純水中，4°C保存；
[0011]3)取步驟2)得到的透明質(zhì)酸修飾的Fe3O4納米材料，用磁鐵吸出所述的納米材料，棄去上清液，將材料重新溶于PBS中，按質(zhì)量比EDC = NHS = 1:1依次加入EDC和NHS反應(yīng)至少Ih ;然后加入與EDC或NHS等質(zhì)量的靶向蛋白分子反應(yīng)至少3h ；
[0012]4)通過外加磁場對步驟3)所得產(chǎn)品進(jìn)行提純，用高純水分散洗滌，最后得到產(chǎn)品雙靶標(biāo)修飾的Fe3O4納米材料，溶于PBS中，4°C保存。
[0013]所述靶向蛋白分子為:轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳鐵蛋白、前列特異性膜抗原抗體或甲胎蛋白抗體。
[0014]所述透明質(zhì)酸分子量范圍:3_6k Da。
[0015]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及效果:
[0016]該方法制備的雙靶標(biāo)Fe3O4納米材料具有合成步驟簡單、合成條件溫和、不含有毒重金屬元素、水溶性和生物相容性良好、T2弛豫率較高和強(qiáng)腫瘤靶向成像能力等優(yōu)良的性質(zhì)，為一種兼具優(yōu)良生物相容性和較強(qiáng)的腫瘤靶向能力的磁共振成像探針。該探針制備方法簡單，在室溫、常壓下即可完成探針制備，所用原料低毒環(huán)保，所選擇配體和靶向蛋白分子生物相容性良好，保證了應(yīng)用的生物安全性，因此是一種生物相容性良好的靶向分子探針。
[0017]該探針有明顯縮短磁共振成像中1~2弛豫時(shí)間的作用，具有較高的弛豫率；探針表面通過兩種靶向識別分子修飾，基于二者優(yōu)良的生物相容性和減少免疫反應(yīng)的發(fā)生，生物安全性良好，具有較低的細(xì)胞毒性和生物活體毒性；基于透明質(zhì)酸對腫瘤組織高表達(dá)CD44受體的強(qiáng)結(jié)合作用，以及靶向蛋白分子和腫瘤細(xì)胞高表達(dá)的特異性受體的強(qiáng)結(jié)合作用，使得該探針具有優(yōu)良的腫瘤識別能力。總之，該探針制備條件溫和、制備方法簡單、原料綠色環(huán)保、核磁性質(zhì)優(yōu)良、生物相容性良好、水溶性好和腫瘤靶向識別能力強(qiáng)，便于規(guī)?；a(chǎn)，其在生物成像領(lǐng)域具有較大的發(fā)展?jié)撃芎蛻?yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0018]圖1為雙靶標(biāo)修飾Fe3O4納米材料的高倍透射電鏡圖。
[0019]圖2為雙靶標(biāo)修飾Fe3O4納米材料的細(xì)胞靶向吸收圖。
[0020]圖3為雙靶標(biāo)修飾Fe3O4納米材料的橫向弛豫率及T 2加權(quán)成像圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021]實(shí)施例1:
[0022]—種生物相容性良好的雙靶標(biāo)修飾Fe3O4納米材料的制備方法，步驟如下:
[0023]I)在 10mL 三口圓底燒瓶中，將 0.5g FeCl3.6H20 和 0.184g FeCl2.4H20 溶于20mLH20中，機(jī)械攪拌溶解，并通以氮?dú)獗Ｗo(hù)。15min之后向上述溶液加入7.5mL質(zhì)量濃度為27% NH4OH,隨后加入5mL透明質(zhì)酸(分子量6k Da，40mg/mL)，室溫下繼續(xù)反應(yīng)30min。
[0024]2)將所得透明質(zhì)酸修飾的Fe3O4納米材料利用外加磁場，用高純水清洗四遍，以除去反應(yīng)雜質(zhì)，然后將材料溶于高純水中，4°C保存。
[0025]3)取5ml步驟2)得到的透明質(zhì)酸修飾的Fe3O4納米材料，用磁鐵吸出所述的納米材料，棄去上清液，將材料重新溶于20ml PBS (pH 7.0，1mM)中，加入5mg EDC，反應(yīng)1min后，加入5mg NHS反應(yīng)Ih。然后加入5mg轉(zhuǎn)鐵蛋白，反應(yīng)4h。
[0026]4)通過外加磁場對步驟3)所得產(chǎn)品進(jìn)行提純，用高純水分散洗滌3次，最后得到產(chǎn)品雙靶標(biāo)修飾的Fe3O4納米材料，溶于5mL PBS(pH 7.4，1mM)中，4°C保存。
[0027]取該實(shí)施例制備的雙靶標(biāo)修飾