用于治療和預(yù)防豬繁殖與呼吸綜合征的組合物和方法
【專利說明】用于治療和預(yù)防豬繁殖與呼吸綜合征的組合物和方法
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年4月24日提交的美國臨時申請?zhí)?1/637, 547的權(quán)益，這個臨 時申請?zhí)卮艘云淙囊玫姆绞讲⑷氡疚闹小?br>[0003] 發(fā)明背景
[0004] 豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS)是在世界范圍內(nèi)豬的慢性病毒疾病。PRRS在大多數(shù) 豬肉生產(chǎn)國家流行，并且其對養(yǎng)豬業(yè)的主要經(jīng)濟損失負責(zé)，據(jù)估計在美國年損失為6. 64億 美元（8)。
[0005] 自1990年代晚期以來，改性活的PRRSV(PRRS-MLV)和殺死的病毒疫苗已經(jīng)可用于 控制疾病，但其中沒有一個對豬完全進行保護來對抗異種野外病毒（27)。如同野外病毒一 樣，PRRS-MLV也誘導(dǎo)免疫抑制（29、30)。此外，有幾個報道是關(guān)于疫苗病毒逆轉(zhuǎn)為病毒性 的，導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病爆發(fā)（31-34)。盡管殺死的PRRSV疫苗是安全的，但其具有較差免疫原 性（35、36)。
[0006] PRRS的臨床征象包含呼吸與繁殖功能障礙并且致病物是PRRS病毒（PRRSV) (28)。PRRSV早在在感染后兩天并且持續(xù)幾周通過調(diào)節(jié)豬的免疫系統(tǒng)來確立疾?。?4、15)。 PRRSV所提出的特別挑戰(zhàn)是由PRRSV引起的免疫抑制，這歸因于病毒介導(dǎo)的重要細胞因子 (IFN-a、IFN-γ和TNF-α )的產(chǎn)生減少，其與白介素（IL)-10和轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF-β) 的分泌增加以及F〇xp3+T調(diào)控細胞（Tregs)群體的上調(diào)相關(guān)聯(lián)（14)。另外，在受感染的豬 中，病毒中和（VN)抗體出現(xiàn)延遲（3-4周），而且其水平保持很低（86)。因此，在本領(lǐng)域中 極大地需要提供針對PRRS的安全而有效的保護和治療。
[0007] 附圖簡述
[0008] 圖1示出了 ： (A)包封滅活的PRRSV的PLGA納米粒子的形態(tài)。通過標(biāo)準(zhǔn)多重乳液 法制備的PLGA納米粒子的掃描電子顯微照片。納米粒子的尺寸似乎在200到600nm的范 圍內(nèi)可變。（B)用包封在納米粒子中的滅活的PRRSV(Nano-KAg)對豬進行粘膜接種疫苗截 止PC15清除了病毒血癥。豬未接種疫苗（η = 3)或者用殺死的PRRSV(K-Ag) (η = 3)或 Nan〇-KAg(n = 3)經(jīng)鼻內(nèi)接種疫苗一次，并且在DPI 21時用PRRSV VR2332病毒株攻擊。分 析在指定的攻擊后天數(shù)（PC)收集的血清樣品以測量PRRSV滴度。每個條形代表了三只豬 的平均值土 SEM。
[0009] 圖2示出了經(jīng)Nano-KAg接種疫苗的病毒攻擊的豬的血清和肺中的增強的IgA和 中和抗體滴度。進行分析以確定以下中的PRRSV中和抗體反應(yīng)：(A)血清；(B)肺，通過免疫 熒光分析法；以及（C)肺裂解物中的抗PRRSV IgA抗體反應(yīng)，通過ELISA。圖中的每個條形 代表了來自三只豬的平均VN滴度或光密度值土SEM。字母'a'、'b'和'c'分別代表了未 接種疫苗對比K-Ag、未接種疫苗對比Nano-KAg以及K-Ag對比Nano-KAg豬之間的統(tǒng)計顯著 差異（p〈0. 05)。
[0010] 圖3示出了用Nano-KAg疫苗經(jīng)鼻內(nèi)接種疫苗的豬的血清和肺中的細胞因子反應(yīng)。 通過ELISA來分析在指定的PC時收集的血清樣品的細胞因子：(A) IFN-Y和（B)TGF-f3。 通過ELISA來分析在尸檢當(dāng)天（PC 15)制備的肺裂解物的以下方面：(C) IFN-γ ; (D) IL-6 ; (E)IL-10;(F)TGF-f3 ;以及（G)IL-4。圖中的每個條形或數(shù)據(jù)點代表了來自三只豬的平均 VN滴度或光密度值土SEM。字母'a'、'b'和'c'分別代表了未接種疫苗對比K-Ag、未接種 疫苗對比Nano-KAg以及K-Ag對比Nano-KAg豬之間的統(tǒng)計顯著差異（p〈0. 05)。
[0011] 圖4示出了 PRRSV特異性回憶細胞因子反應(yīng)的分析。再刺激指定的單核細胞，并 且通過ELISA來分析所收集的培養(yǎng)上清液的細胞因子：(A到D) IFN- γ ; (E到H) IL-12 ; (I 和J) IL-6 ;以及（Κ和L) TGF- β。從測試值中扣除在沒有滅活的PRRSV的情況下培養(yǎng)的免 疫細胞分泌的細胞因子。圖中的每個條形代表了來自三只豬的平均細胞因子量土SEM。字 母'a'、'b'和'c'分別代表了未接種疫苗對比K-Ag、未接種疫苗對比Nano-KAg以及K-Ag 對比Nano-KAg豬之間的統(tǒng)計顯著差異（p〈0. 05)。
[0012] 圖5示出了 CD和CD8陽性T細胞亞群的細胞計數(shù)分析。對指定的單核細胞進行免 疫染色以分析免疫細胞的頻率：(A到D) CD3+細胞；(E到H) CD8 +T細胞；（I到L) CD4+T細胞； 以及（M到P)CD4+CD8+T細胞。圖中的每個條形代表了來自三只豬的免疫細胞的平均百分比 土SEM。字母'a'、'b'和'c'分別代表了未接種疫苗對比K-Ag、未接種疫苗對比Nano-KAg 以及K-Ag對比Nano-KAg豬之間的統(tǒng)計顯著差異（p〈0. 05)。
[0013] 圖6示出了先天和調(diào)控T細胞的細胞計數(shù)分析。對指定的單核細胞進行免疫染色 以確定免疫細胞的頻率：(A到D) γ δ T細胞；(E到H)骨髓細胞；（I到K)樹突狀細胞富含 部分；以及（L、M和N)Tregs。圖中的每個條形代表了來自三只豬的免疫細胞的平均百分比 土SEM。字母'a'、'b'和'c'分別代表了未接種疫苗對比K-Ag、未接種疫苗對比Nano-KAg 以及K-Ag對比Nano-KAg豬之間的統(tǒng)計顯著差異（p〈0. 05)。
[0014] 圖7示出了在體外豬肺泡M s中的Nano-KAg的表征。（A)通過標(biāo)準(zhǔn)多重乳液法 制備的包封PRRSV Ag的PLGA納米粒子的掃描電子顯微照片。共焦顯微鏡照片：(B)將ΜΦ 用殺死的PRRSV (K-Ag)、Nano-KAg處理，或用PRRSV感染，然后用PRRSV N蛋白質(zhì)特異性 mAb、接下來用Alexa 488抗小鼠抗體處理；PRRSV N蛋白質(zhì)在Μφ的核內(nèi)體中的共定位，（C) 經(jīng)Nano-KAg處理，以及（D)經(jīng)PRRSV感染。（E)經(jīng)Nano-KAg處理的骨髓細胞（CD172+)中 ⑶80/86的上調(diào)。每個條形代表了從三只豬收集的模擬的、經(jīng)K-Ag處理和經(jīng)Nano-KAg處 理的BAL細胞中對⑶80/86標(biāo)志物呈陽性的ΜΦ的平均百分比+/-SEM。星號代表了接受 Nano-KAg與接受K-Ag的豬組之間的統(tǒng)計顯著差異（ρ〈0. 05)。（F)示出如所指示經(jīng)處理的 ΜΦ中PRRSV-N蛋白質(zhì)的存在的代表性直方圖。在三個獨立的試驗中獲得類似的結(jié)果。
[0015] 圖8示出了在攻擊前研宄中Nano-KAg引發(fā)增強的先天反應(yīng)和抑制的調(diào)控反應(yīng)。 豬未接種疫苗或者用K-Ag或Nano-KAg經(jīng)鼻內(nèi)接種疫苗一次。進行免疫染色以分析免疫細 胞的頻率：肺MNC中的（A) NK細胞，（B)樹突狀細胞，（C) γ δ T細胞，（D)Th/記憶細胞，（E) ⑶8+Τ細胞；以及PBMC中的（H) γ δ T細胞和（I)樹突狀細胞。通過ELISA來分析從再刺激 的免疫細胞收集的培養(yǎng)上清液的細胞因子：肺MNC中的（F) IL-IO和（G) IL-6 ;以及PBMC中 的（J)IL-IO ;還有血清中的（K)IFN-a。每個條形代表了來自三只豬的平均量土SEM。星 號代表了接受Nano-KAg與接受K-Ag的豬組之間的統(tǒng)計顯著差異（ρ〈0. 05)。
[0016] 圖9示出了經(jīng)Nano-KAg接種疫苗的麗184攻擊的豬中減少的肺病變和病毒負荷。 豬未接種疫苗或者用K-Ag或Nano-KAg經(jīng)鼻內(nèi)接種疫苗一次，在PID 21時用PRRSV ΜΝ184 病毒株攻擊并且在DPC 15時施以無痛致死術(shù)。（A)來自指定豬組的代表性豬肺Η&Ε照片。 ⑶來自指定豬組的代表性肺免疫組織化學(xué)（IHC)照片，其示出了用諾瓦紅（Nova red)染 色的PRRSV N抗原陽性細胞（放大的圖像中的星號）。（C)基于受影響的肺區(qū)域的百分比 和炎性病變的嚴(yán)重程度對總體肺損傷進行評級。（D)在來自每只豬的10個隨機場中對IHC 中的PRRSV N抗原陽性細胞進行計數(shù)。通過免疫熒光分析法來測定在指定的DPC時（E)血 清中以及在DPC 15時（F)肺中以熒光焦點單位表示的PRRSV滴度。每個條形代表了來自 三只豬的平均值土SEM。星號代表了接受Nano-KAg與接受K-Ag的豬組之間的統(tǒng)計顯著差 異（p〈0. 05)。在獨立的第二個試驗中獲得類似的結(jié)果趨勢。
[0017] 圖10示出了經(jīng)Nano-KAg接種疫苗的麗184病毒株攻擊的豬中增強的PRRSV特異 性IgA和中和抗體反應(yīng)。豬未接種疫苗或者用K-Ag或Nano-KAg經(jīng)鼻內(nèi)接種疫苗一次，在 PID 21時用PRRSV MN184病毒株攻擊并且在DPC 15時施以無痛致死術(shù)。通過ELISA來測 定㈧肺、(D)血清和（G)鼻拭子中的抗PRRSV IgA抗體反應(yīng)；以及⑶肺、(E)血清和⑶ 鼻拭子中的IgG抗體反應(yīng)。通過免疫熒光分析法來測定（C)肺和（F)血清中的PRRSV中和 抗體反應(yīng)。每個條形代表了來自三只豬的平均光密度值或VN滴度土SEM。星號代表了接受 Nano-KAg與接受K-Ag的豬組之間的統(tǒng)計顯著差異（p〈0. 05)。在獨立的第二個試驗中獲得 類似的結(jié)果趨勢。
[0018] 圖11示出了 Nano-KAg引發(fā)豬肺中增強的先天免疫反應(yīng)。豬未接種疫苗或者用 K-Ag或Nano-KAg經(jīng)鼻內(nèi)接種疫苗一次，在PID 21時用PRRSV MN184病毒株攻擊并且在DPC 15時施以無痛致死術(shù)。通過ELISA來分析肺勻漿的細胞因子（A)IFN-a。通過流式細胞計 數(shù)法來分析肺MNC的（B) NK細胞，（D)y δ T細胞，（E)⑶4+T細胞，以及（F)⑶8+T細胞。通 過LDH分析法從細胞毒性功能來分析存在于肺MNC中的（C) NK細胞。圖中的每個條形或數(shù) 據(jù)點代表了來自三只豬的平均值土SEM。星號代表了接受Nano-KAg與接受K-Ag的豬組之 間的統(tǒng)計顯著差異（Ρ〈〇. 05)。在獨立的第二個試驗中獲得類似的結(jié)果趨勢。
[0019] 圖12示出了經(jīng)Nano-KAg接種疫苗的麗184攻擊的豬肺中免疫抑制反應(yīng)的減少。 豬未接種疫苗或者用K-Ag或Nano-KAg經(jīng)鼻內(nèi)接種疫苗一次，在PID 21時用PRRSV ΜΝ184 病毒株攻擊并且在DPC15時施以無痛致死術(shù)。通過流式細胞計數(shù)法來分析肺MNC的（A) Tregs群體。分析肺勻漿的（B) IL-10,（C) TGF-β，以及（D) IFN-α。通過ELISA來分析從 再刺激的肺MNC收集的培養(yǎng)上清液的細胞因子：(E) IL-10,（F) TGF-β，以及（G) IFN-γ。每 個條形代表了來自三只豬的平均值土SEM。星號代表了接受Nano-KAg與接受K-Ag的豬組 之間的統(tǒng)計顯著差異（Ρ〈〇. 05)。在獨立的第二個試驗中獲得類似的結(jié)果趨勢。
[0020] 圖13示出了經(jīng)Nano-KAg接種疫苗的麗184病毒株攻擊的豬的PBMC和TBLN中增 加的PRRSV特異性回憶細胞因子反應(yīng)。豬未接種疫苗或者用K-Ag或Nano-KAg經(jīng)鼻內(nèi)接 種疫苗一次，在PID 21時用PRRSV ΜΝ184病毒株攻擊并且在DPC 15時施以無痛致死術(shù)。 通過ELISA來分析從再刺激的PBMC和TBLV MNC收集的培養(yǎng)上清液的細胞因子：(Α和Ε) IL-10,（B)TGF-f3，（C和F)IFN-y，以及（D和G)IL-6。每個條形代表了來自三只豬的平均 值土SEM。星號代表了接受Nano-KAg與接受K-Ag的豬組之間的統(tǒng)計顯著差異（p〈0. 05)。 在獨立的第二個試驗中獲得類似的結(jié)果趨勢。
[0021] 圖14示出了通過ELISA針對指定的PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和總病毒蛋白質(zhì)對豬的支 氣管肺泡灌洗液中PRRSV特異性IgA抗體產(chǎn)生的估算。
[0022] 圖15示出了通過ELISA針對總PRRSV蛋白質(zhì)對血液中PRRSV特異性總IgG抗體 滴度的估算。PC-攻擊后天數(shù)；接種疫苗-第1次接種疫苗；加強-加強劑量。
[0023] 圖16示出了通過免疫熒光分析法對豬肺中PRRSV特異性中和滴度（VNT)的估算。
[0024] 圖17示出了通過免疫熒光分析法對豬的血液樣品中PRRSV特異性中和滴度（VNT) 的估算。PC-攻擊后天數(shù)；接種疫苗-第1次接種疫苗；加強-加強劑量。
[0025] 圖18示出了通過ELISP0T分析法測定的在豬肺中對指定的PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和 總病毒蛋白質(zhì)具特異性的IFN-Y分泌細胞的頻率。
[0026] 圖19 (A和B)示出了通過定量實時PCR(qRT-PCR)對肺中PRRSV RNA拷貝數(shù)的測 定，并且（C和D)示出了通過免疫熒光分析法測定的在豬肺中感染性PRRSV滴度的測定。
[0027] 圖20示出了通過免疫熒光分析法測定的在豬的血液樣品中感染性PRRSV負荷的 測定。
[0028] 圖21示出了通過免疫熒光分析法對豬肺中感染性PRRSV滴度的測定。A和B是陰 性和陽性對照，并且C到H是500 μ g/豬的疫苗劑量類別的指定豬組（η = 3)的肺勻漿中 病毒負荷的代表性照片。
[0029] 圖22示出了經(jīng)納米粒子包封的PRRSV K-Ag+結(jié)核分枝桿菌WCL接種疫苗并且經(jīng) 異種PRRSV攻擊的豬中免疫反應(yīng)和病毒清除的總結(jié)。
[0030] 圖23示出了用PLGA納米粒子包封的PRRSV疫苗經(jīng)鼻內(nèi)接種疫苗并且用異種病毒 攻擊的豬中抗PRRSV免疫的示意圖。
[0031] 圖24Α、24Β和24C示出了包封PRRSV KAg的PLGA納米粒子（NP-KAg)的表征。 (A)用20kV和30, OOOx放大率的Philips XL30-FEG SEM獲取照片。（B)在正常生理條件 下表現(xiàn)來自NP-KAg的PRRSV Ag的釋放型態(tài)。（C)在處理后的指定時間點由豬的PAM細胞 對NP-KAg的吸收。每個免疫熒光照片代表每個處理條件：（i)KAg ; (ii)NP-KAg ; (iii)假的 NP;(iv)細胞對照；(V)經(jīng)PRRSV(VR2332)感染。在其它兩個獨立的實驗中獲得類似的結(jié) 果。
[0032] 圖25A-25F示出了經(jīng)加佐劑的NP-KAg接種疫苗的豬中PRRSV特異性抗體的顯著 增加。豬用指定的疫苗與佐劑的組合接種疫苗或未接種疫苗并且用PRRSV MN184攻擊。通 過ELISA來分析在指定的PC時收集的肺和血液樣品的病毒特異性IgA (A和C)和IgG (B、 D、E和F) : (A和B)BAL液；(C、D)肺勻漿；(E、F)血漿樣品。線圖中的每個條形和每個符號 指示了三只豬的平均值土SEM。星號和小寫字母指示了如方法中所描述的指定組之間的統(tǒng) 計顯著差異。在另一個獨立的實驗中獲得類似的結(jié)果趨勢。
[0033] 圖26A-26F示出了經(jīng)加佐劑的NP-KAg接種疫苗的豬中增強的異種和異基因型 PRRSV中和抗體（VN)滴度。如圖例25中所描述對豬接種疫苗并攻擊。分析在指定的 PC時收集的肺勻漿（A、B、E-Η)和血漿（C、D)樣品的PRRSV VN滴度：(A-D)針對攻擊的 PRRSV(MN184)的 VN 滴度；（E、F)PRRSV(1-4-4) ;(G、H)PRRSV(SD03-15)。線圖中的每個條形 和每個符號指示了三只豬的平均值土SEM。星號和小寫字母指示了如方法中所描述的指定 組之間的統(tǒng)計顯著差異。
[0034] 圖27A-27I示出了經(jīng)加佐劑的NP-KAg疫苗（500 μ g/豬的類別）接種疫苗的豬 中增強的Thl-Th2產(chǎn)生和抑制的免疫抑制性細胞因子。如圖例25中所描述對豬接種疫苗 并攻擊。㈧用殺死的麗184Ag再刺激肺MNC并且通過ELISP0T來測量IFN-γ分泌細胞 (ISC)的頻率。通過ELISA來分析肺勻漿的以下方面：(B) IFN-γ ; (D) IL-12 ; (C) IL-6 ; (E) TGF- β ; (F) IL-10。用殺死的MN184Ag再刺激PBMC并且通過ELISA來分析上清液的以下方 面：(G) IL-4 ; (H) IL-6 ; (I) IL-IO。每個條形指示了來自三只豬的每百萬個LMNC的ISC的 平均數(shù)或細胞因子的平均值土SEM。星號指示了指定豬組之間的統(tǒng)計顯著差異。在獨立的 第二個實驗中獲得類似的結(jié)果趨勢。