干后適當切碎，置破碎提取器的容器中，用折合吊 球草干重6倍量的75%含水乙醇進行破碎提取3次，每次1. 5分鐘。（2)閃蒸濃縮和脫色： 將得到的提取液抽濾或甩濾，棄去濾渣，將提取液在70°C以下采用真空薄膜濃縮裝置進行 閃蒸濃縮至原體積的一半。加入折合藥材干重2. 5%的粉狀活性炭，室溫下超聲處理0. 5 小時，抽濾，除去活性炭，繼續(xù)在70°C以下采用真空薄膜濃縮裝置進行閃蒸濃縮至原體積的 1/6。（3)乙醚萃取物的制備：將濃縮液超聲分散到水中，水的用量為濃縮液體積的30%。用 乙醚做溶劑萃取4次，每次用量為濃縮液體積的1倍量。每次靜止分層后，分去乙醚層。合 并乙醚萃取液，在旋轉蒸發(fā)儀中常壓濃縮蒸出乙醚，得到乙醚萃取部位的濃縮液。繼續(xù)將乙 醚萃取部位的濃縮液進行真空旋蒸濃縮，抽成干粉，得到乙醚提取物干粉。（4)乙酸乙酯萃 取物的制備：將乙醚萃取后分出的水層濃縮液，改用乙酸乙酯做溶劑萃取5次，每次用量為 濃縮液體積的2. 5倍量。靜止分層后，分去乙酸乙酯層。合并乙酸乙酯萃取液，在閃蒸濃縮 裝置中，60°C以下真空減壓濃縮蒸出乙酸乙酯后，得到乙酸乙酯萃取部位的濃縮液。繼續(xù)將 濃縮液進行真空干燥成粉，得到乙酸乙酯提取物干粉。（5)正丁醇萃取物的制備：將乙酸乙 酯萃取后分出的水層濃縮液，改用正丁醇萃取4次，每次用量為濃縮液體積的1倍量，靜止 分層后，分去正丁醇層。合并正丁醇萃取液，在80°C以下在閃蒸濃縮裝置中進行真空減壓濃 縮，蒸出正丁醇后得到正丁醇部位濃縮液。繼續(xù)將濃縮液進行真空干燥成粉，得到正丁醇提 取物干粉。將乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物按照重量比1:3組合，得到抗腫瘤藥效活性 物質。
[0020] 以下結合相應的試驗數(shù)據(jù)對本發(fā)明作進一步說明。
[0021] 試驗1 :體外抗腫瘤活性試驗（MTT法） MTT法又稱MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法，由于細胞活力與細胞數(shù)呈 正相關，因此也常常用來檢測細胞的增殖情況。該方法已廣泛用于生物活性因子的活性檢 測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗等。具有靈敏度高、快速和經(jīng)濟的特點。
[0022] 測定原理：四氮挫[MTT, 3_(4, 5-dimethylibiazol_2-yl)_2, 5-diphenyl-tetrazolium bromide]是一種能接受氫原子的染料。MTT的化學名為3-(4,5_二甲基噻 唑-2) -2, 5-二苯基四氮唑溴鹽(商品名：噻唑藍)?；罴毎€粒體中與NADP相關的脫氫酶在 細胞內可將黃色的MTT轉化成不溶性的藍紫色的甲月替，死細胞則不具有此功能。二甲基 亞砜（DMSO)能溶解細胞中的甲瓚，用樣品用DMSO溶解后，在一定波長下用酶標儀在490nm (或570nm)波長處測定其光密度值，即可定量測出細胞的存活率。在一定細胞數(shù)范圍內， MTT結晶形成的量與細胞數(shù)成正比。
[0023] 材料和儀器：多功能酶標儀；細胞培養(yǎng)箱；生物安全柜；微電腦電熱恒溫水槽；旋 轉蒸發(fā)儀、循環(huán)水泵。96孔細胞培養(yǎng)板。體外培養(yǎng)的人肝癌細胞株：人肝癌H22、人肝癌PLC/ PRF/5、人肝癌BEL-7404和人肝癌HCC-9204細胞株；PBS參照《細胞培養(yǎng)》配制。磷酸緩沖 液 PBS: (NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HP04 1.44g，KH2P04 0 . 24 g，調 pH 7.4，定容 1L);培養(yǎng)液； 胰蛋白酶；小牛血清；胎牛血清；MTT試劑盒；二甲基亞砜；其他試劑為分析純。
[0024] 實驗步驟：選取長勢良好的對數(shù)期的貼壁的腫瘤細胞，在培養(yǎng)皿底部達50%到 90%融合，吸去培養(yǎng)液，加入一定量的PBS，漂洗細胞后吸去PBS，以清洗細胞。加入0. 5毫 升0. 4%胰蛋白酶EDTA溶液，覆蓋培養(yǎng)皿底部使所有細胞接觸胰蛋白酶。將其放置在36 度5% CO2培養(yǎng)箱中進行胰蛋白酶消化。加入培養(yǎng)液，用微量移液器頭吹打細胞，成單個細 胞混懸液，計數(shù)細胞濃度。用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基配成5000個/mL的細 胞懸液，以每孔一定數(shù)目的細胞，將細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔體積200 μ L，37°C， 5%的CO2培養(yǎng)24小時后給藥，并設置陽性對照組和陰性對照組。以實施例2為藥物樣品， 用DMSO溶解，藥物設置12. 5、25、50、100 μ g · ml/1 4個濃度梯度，每個濃度梯度四個復孔 給藥。
[0025] MTT比色法檢測：實驗組更換新的含不同濃度被測樣品的培養(yǎng)基，對照組則更換 含等體積溶劑的培養(yǎng)基，37°C，5%的0) 2繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，除去上清液，每孔加入MTT溶 液（5mg/mL，用PBS配制，pH=7. 4) )20 μ L，37 °C條件下于恒溫箱培養(yǎng)4小時后，終止培養(yǎng)， 小心吸棄孔內培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μ L DMS0,脫色搖床震蕩溶解10 min，在酶標儀上 以試驗波長為570 nm，參比波長為450 nm測定OD值，計算腫瘤細胞增殖的抑制率，腫瘤細 胞生長抑制率％=( I-OD實驗/ OD對照）X 100%。以相同樣品的不同濃度對腫瘤細胞生長 抑制率作圖，得到樣品濃度和抑制率的關系曲線，從中求出樣品的IC5tl值。IC 5tl為抑制癌細 胞生長50%時的藥物濃度（μ g · ml/1)。植物提取物純品的IC5Q< 10 μ g · mL η或植物粗 提物的IC5(I< 20 yg · mL-1時，則可判斷樣品對腫瘤細胞有殺傷作用，即具有抗腫瘤活性。 不同萃取部位及組合物體外抗腫瘤活性的IC 5tl值見表1。
【主權項】
1. 從天然植物中提取的藥效活性物質，其特征在于采用以下方法制備： 1) 原料的粉碎和提?。簩⒌跚虿輹窀珊筮m當切碎，置破碎提取器的容器中，按照吊球草 干重Ikg則含水乙醇用量為5-8升的比例，將碎吊球草用55% -80%含水乙醇進行破碎提 取1-3次，每次1-4分鐘； 2) 閃蒸濃縮和脫色：將步驟1)得到的提取液抽濾或甩濾，棄去濾渣，將提取液在 60_75°C采用真空薄膜濃縮裝置進行閃蒸濃縮至原體積的1/2-1/3 ;按照吊球草干重1-3% 的比例加入粉狀活性炭，室溫下超聲處理0. 5-2小時，抽濾，除去活性炭，繼續(xù)在60-75°C采 用真空薄膜濃縮裝置進行閃蒸濃縮至原體積的1/6-1/8 ; 3) 乙醚萃取物的制備：將步驟2)得到的濃縮液超聲分散到水中，水的用量為濃縮液體 積的25-35% ;用乙醚做溶劑萃取3-6次，每次用量為濃縮液體積的1-3倍；每次靜止分層 后，分去乙醚層；合并乙醚萃取液，在旋轉蒸發(fā)儀中常壓濃縮蒸出乙醚，得到乙醚萃取部位 的濃縮液；繼續(xù)將乙醚萃取部位的濃縮液進行真空旋蒸濃縮，抽成干粉，得到乙醚提取物干 粉； 4) 乙酸乙酯萃取物的制備：將乙醚萃取后分出的水層濃縮液，改用乙酸乙酯做溶劑萃 取3-6次，每次用量為濃縮液體積的1. 5-3倍量；靜止分層后，分去乙酸乙酯層；合并乙酸 乙酯萃取液，在閃蒸濃縮裝置中，55-65°C真空減壓濃縮蒸出乙酸乙酯后，得到乙酸乙酯萃 取部位的濃縮液；繼續(xù)將濃縮液進行真空干燥成粉，得到乙酸乙酯提取物干粉； 5) 正丁醇萃取物的制備：將乙酸乙酯萃取后分出的水層濃縮液，改用正丁醇萃取2-5 次，每次用量為濃縮液體積的0. 5-1. 5倍量，靜止分層后，分去正丁醇層；合并正丁醇萃取 液，在70-85°C下在閃蒸濃縮裝置中進行真空減壓濃縮，蒸出正丁醇后得到正丁醇部位濃縮 液；繼續(xù)將濃縮液進行真空干燥成粉，得到正丁醇提取物干粉； 6) 將乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物按照重量比1:1-3組合，得到抗腫瘤藥效活性物 質。
2. 如權利要求1所述的從天然植物中提取的藥效活性物質，其特征在于步驟1)中：按 照吊球草干重Ikg則含水乙醇用量為6-7升的比例，將碎吊球草用60% -70%含水乙醇進 行破碎提取2次，每次2-3分鐘。
3. 如權利要求1所述的從天然植物中提取的藥效活性物質，其特征在于步驟2)中：將 提取液在70°C采用真空薄膜濃縮裝置進行閃蒸濃縮至原體積的1/2. 5。
4. 如權利要求1所述的從天然植物中提取的藥效活性物質，其特征在于步驟2)中：按 照吊球草干重1. 5-2. 5%的比例加入粉狀活性炭，室溫下超聲處理1-1. 5小時，抽濾，除去活 性炭，繼續(xù)在70°C采用真空薄膜濃縮裝置進行閃蒸濃縮至原體積的1/7。
5. 如權利要求1所述的從天然植物中提取的藥效活性物質，其特征在于步驟3)中： 水的用量為濃縮液體積的28-32% ;用乙醚做溶劑萃取4-5次，每次用量為濃縮液體積的 1. 5-2. 5 倍。
6. 如權利要求1所述的從天然植物中提取的藥效活性物質，其特征在于步驟4)中：將 乙醚萃取后分出的水層濃縮液，改用乙酸乙酯做溶劑萃取4-5次，每次用量為濃縮液體積 的2-2. 5倍量；60°C真空減壓濃縮蒸出乙酸乙酯后，得到乙酸乙酯萃取部位的濃縮液。
7. 如權利要求1所述的從天然植物中提取的藥效活性物質，其特征在于步驟5)中：將 乙酸乙酯萃取后分出的水層濃縮液，改用正丁醇萃取3-4次，每次用量為濃縮液體積的1倍 量；合并正丁醇萃取液，在80°C下在閃蒸濃縮裝置中進行真空減壓濃縮，蒸出正丁醇后得 到正丁醇部位濃縮液。
8. 如權利要求1所述的從天然植物中提取的藥效活性物質，其特征在于步驟6)中：乙 酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物按照重量比1:1. 5-2. 5組合，得到抗腫瘤藥效活性物質。
9. 如權利要求1所述的從天然植物中提取的藥效活性物質在制備防治抗腫瘤藥物制 劑中的應用。
【專利摘要】從天然植物中提取的藥效活性物質及其用途，屬于天然植物提取技術領域。采用以下方法制備：1）原料的粉碎和提?。?）閃蒸濃縮和脫色；3）乙醚萃取物的制備；4）乙酸乙酯萃取物的制備；5）正丁醇萃取物的制備；6）將乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物按照重量比1:1-3組合，得到抗腫瘤藥效活性物質。上述從天然植物中提取的藥效活性物質及其用途，其天然活性物質對人肝癌細胞的增殖具有明顯的抑制作用，對H22小鼠肝臟實體瘤和腹水瘤均具有明顯的抑瘤作用，特別是高劑量組，能明顯抑制H22小鼠的腫瘤生長，延長小鼠的存活時間，為治療肝腫瘤，延長生存時間和提高生命質量提供了時機。
【IPC分類】A61P35-00, A61K36-53
【公開號】CN104814999
【申請?zhí)枴緾N201510231610
【發(fā)明人】袁珂, 蔡榮榮, 段芳芳
【申請人】浙江農(nóng)林大學暨陽學院
【公開日】2015年8月5日
【申請日】2015年5月8日