一種中空開放明膠細胞微載體及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于組織工程的生物材料技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種中空開放明膠細胞微載體及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]組織工程和再生醫(yī)學技術(shù)是一種新興的組織器官再生與修復(fù)手段，是建立在化學、材料學、生命科學和工程學等基礎(chǔ)上的交叉學科，經(jīng)過二十余年快速發(fā)展，已繼外科重建和器官移植后，第三種組織和器官缺損或功能衰竭的治療手段。組織工程的三個關(guān)鍵因素分別是種子細胞的培養(yǎng)，組織支架的制備以及細胞支架復(fù)合體的形成，其中核心是細胞和生物材料所構(gòu)成的細胞支架復(fù)合體。細胞微載體是近二十多年發(fā)展起來并得到廣泛應(yīng)用的細胞復(fù)合支架，既不改變細胞附著表面生長成單層的特性，又大大提高了培養(yǎng)表面積和容積之比，使細胞得到較大規(guī)模的培養(yǎng)。生物降解細胞微載體不僅可以作為細胞的高密度培養(yǎng)微載體，也可以作為組織工程中的可注射型細胞載體用于對組織和器官缺損的修復(fù)和再生。
[0003]但是，以往研宄的生物降解微載體均是微球狀載體，在成骨細胞/微載體/水凝膠復(fù)合體系體內(nèi)注射的實驗當中表明，該體系輸送細胞的效率相對不高，細胞僅能依附于載體表面單層生長，而復(fù)合體系中大多數(shù)空間被無細胞的載體或水凝膠所占據(jù)，不利于大量地高密度輸送治療細胞，為新生組織預(yù)留的空間也不足。雖然利用多孔的微球代替實心微球，可以部分解決這一問題，但由于這種材料要滿足注射治療的需要，因此需要這種多孔微球的內(nèi)部網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)非常小，而這么小的網(wǎng)孔使得細胞很難進入微載體球體中心部位。
[0004]因此，需要設(shè)計制備新型結(jié)構(gòu)的細胞微載體，滿足可注射組織修復(fù)的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有生物降解微載體的缺陷和技術(shù)不足，提供一種即可滿足可注射組織修復(fù)的需要，又具有很高的細胞輸送效率，而且具有很好的生物相容性和生物可降解性的中空開放明膠細胞微載體。
[0006]本發(fā)明另一目的是提供上述中空開放明膠細胞微載體的制備方法。
[0007]本發(fā)明再一目的是提供上述中空開放明膠細胞微載體的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
一種中空開放明膠細胞微載體的制備方法，首先以明膠和蜂蠟為原料，使用雙乳法制備明膠蜂蠟微球，再在乙醇/水溶液中重塑，然后在戊二醛/乙醇溶液中交聯(lián)，最后擠出明膠微球內(nèi)部的蜂蠟小球，得到中空開放明膠細胞微載體。
[0009]具體地，上述制備方法包括如下步驟:
S1.雙乳法制備明膠蜂蠟微球
511.明膠水溶液加熱至70?80°C，加入蜂蠟，攪拌5?lOmin，得到蜂蠟/明膠乳液；
512.將蜂錯/明膠乳液倒入60°C預(yù)熱好的食用油中，攪拌、乳化10?15min;然后倒Λ -20?4°C預(yù)冷的冰乙醇中，靜置；
S13.二氧六環(huán)/丙酮溶液反復(fù)清洗(除去食用油)，干燥，得到明膠蜂蠟微球；
52.把明膠蜂蠟微球依次放進乙醇溶液、戊二醛溶液中進行重塑和交聯(lián)；
53.最后對明膠蜂蠟微球進行擠壓，去掉球內(nèi)的蜂蠟，即得中空開放明膠細胞微載體。
[0010]更具體地，上述制備方法的步驟如下:
51.雙乳法制備明膠蜂蠟微球
511.配制1%(w/v)明膠水溶液，加熱至70?80°C，在400?700rpm的攪拌下，加入蜂蠟，攪拌3?15分鐘；明膠與蜂蠟的用量比為1:1?5 ;
512.將Sll所得乳液倒入60°C預(yù)熱的食用油中，在200?600轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下乳化5?30分鐘；
513.將S12所得混合液倒入_20°C預(yù)冷的冰乙醇中，靜置15?30分鐘；
514.用二氧六環(huán)/丙酮溶液反復(fù)清洗，干燥，得到明膠蜂蠟微球(明膠蜂蠟微球的直徑為200?400 μ m，適用于制備大小合適的微載體)；
52.重塑:將SI所得明膠蜂蠟微球置于70?85%乙醇/水溶液中，70°C重塑3?8分鐘，干燥得到重塑后的明膠蜂蠟微球；
53.戊二醛交聯(lián):將重塑后的明膠蜂蠟微球放置在戊二醛/乙醇溶液中，4°C交聯(lián)10?24h，乙醇反復(fù)清洗，真空干燥得到交聯(lián)后明膠蜂蠟微球；
54.擠壓去蠟:用力擠壓交聯(lián)后明膠蜂蠟微球，所有微球均被擠破后，浸泡在正己烷溶液中，過夜，乙醇清洗多次，干燥即得中空開放明膠微載體。
[0011]其中，優(yōu)選地，步驟S2的具體操作如下:
521.取明膠蜂蠟微球置于細胞培養(yǎng)板(如24孔板)中，細胞培養(yǎng)板在桌面上輕輕敲打，使微球顆粒緊密堆積，表面平整；
522.用注射器將85%的乙醇溶液注射入微球中，明膠蜂蠟微球和乙醇的用量比為Ig/
mL ；
523.將細胞培養(yǎng)板移至70°C烘干5?8min，取出細胞培養(yǎng)板，以濾紙輕壓明膠蜂蠟微粒表面，使粒子之間緊密粘連，并吸走多余的乙醇溶液；
524.把細胞培養(yǎng)板放置在-200C冷凍20min后取出，并真空干燥，得到重塑后的明膠蜂蠟微球(明膠微球重塑的時間以輕輕碰觸，表面剛粘連成片為準)。
[0012]優(yōu)選地，步驟S3所述戊二醛/乙醇溶液中戊二醛:乙醇=5:95 (S卩5%的戊二醛溶液)。
[0013]優(yōu)選地，步驟S4具體是將交聯(lián)后明膠蜂蠟微球均勻鋪張在錫箔紙上，用研磨棒均勻用力擠壓，觀察所有微球均被擠破后，放置于正己烷溶液中浸泡過夜，無水乙醇清洗三次，干燥即得中空開放明膠微載體。
[0014]優(yōu)選地，S12所述食用油的用量按照水油相比為1:5進行。
[0015]優(yōu)選地，S12所述食用油為花生油。
[0016]按照上述制備方法制備得到的中空開放明膠細胞微載體及其應(yīng)用也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0017]所述制備得到的中空開放明膠細胞微載體可應(yīng)用于細胞培養(yǎng)，尤其是細胞大規(guī)模培養(yǎng)，還可應(yīng)用于組織工程中骨缺損的填充修復(fù)材料。
[0018]本發(fā)明首次利用蜂蠟作為致孔劑，利用雙乳液法制備明膠微球，并通過大量的研宄和探索，制備出了一種中空開放的明膠細胞微載體。本發(fā)明采用的技術(shù)、表征手段及應(yīng)用方式包括明膠蜂蠟微球制備、明膠蜂蠟微球重塑、中空開放明膠微載體制備、倒置熒光顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察、中空開放明膠微載體表面細胞修飾和評價及體內(nèi)修復(fù)脛骨缺損實驗。
[0019]為驗證技術(shù)的有效性，本發(fā)明主要采用以下方法進行檢測:1)倒置熒光顯微鏡觀察制備中空開放明膠微載體過程中載體形狀變化情況；2)掃描電子顯微鏡監(jiān)測中空開放明膠微載體制備情況；3)層層自組裝法提高中空開放明膠微載體表面生物相容性；4)把P4代骨髓間充質(zhì)干細胞接種在滅菌后的中空開放明膠微載體上，培養(yǎng)5天后，進行死活細胞染色；5)把接種細胞后的微載體填充在兔脛骨缺損部位，修復(fù)一個月后，取脛骨進行蘇木精/伊紅染色，評價中空開放明膠細胞微載體修復(fù)骨缺損的能力。具體分析步驟如下:
(1)通過倒置熒光顯微鏡觀察明膠蜂蠟重塑前后及中空開放明膠微載體的外觀；
(2)通過掃描電子顯微鏡觀察明膠微球重塑前后、交聯(lián)后及中空開放明膠微載體的形貌，判斷最終制備的微載體是否具備中空開放殼層結(jié)構(gòu)；
(3)通過層層自組裝技術(shù)，在中空開放明膠微載體表面接上生物大分子(膠原、生長因子、肝素及酪蛋白)，使其獲得適宜于成骨再生的材料界面；
(4)Dead/Live熒光染色分析骨髓間充質(zhì)干細胞在中空開放明膠微載體的生長情況；
(5)對填充細胞微載體一個月后的脛骨進行HE染色，檢測缺損位置新生組織生長情況，從而分析中空開放明膠細胞微載體在組織工程骨缺損的填充修復(fù)材料中的應(yīng)用前景。
[0020]本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明首次使用蜂蠟作為致孔劑，利用雙乳液法制備明膠微球，在乙醇/水加熱環(huán)境下處理一定時間后，進行干燥，是明膠表面形成一層致密的殼層，加入一定濃度的戊二醛/乙醇溶液使其表面交聯(lián)。微球干燥后，用力擠壓，明膠微球內(nèi)部的蜂蠟小球受力，使表面的交聯(lián)層破裂，從而得到具有中空開放殼層結(jié)構(gòu)的明膠微載體，可以用于所以貼壁細胞的大規(guī)模培養(yǎng)，亦可以于可注射細胞微載體/水凝膠復(fù)合支架修復(fù)骨缺損。
[0021]同時，本發(fā)明方法操作工藝簡單、實施條件溫和，所使用的明膠是一種來源豐富的天然高分子材料，具有很好的生物降解性和細胞相容性，并創(chuàng)造性地使用無毒性、可食用的蜂蠟作為致孔劑，蜂蠟熔點為62?67°C，可溶于有機溶劑，所得微載體無毒，因而得到的中空開放明膠微載體具有優(yōu)良的生物相容性。而且由于內(nèi)部具有空腔結(jié)構(gòu)而表現(xiàn)出低密度、高比表面積等特點，其中空開放殼層結(jié)構(gòu)使得細胞不僅能在表面生長，還很容易的可以進入微載體內(nèi)部生長，增大了生長面積，同時又為細胞的增值提供了三維空間和新陳代謝的環(huán)境，細胞能夠有效地粘附、生長以及增值，為細胞大規(guī)模的培養(yǎng)提供了可能。這種生物可降解細胞微載體既可以作為細胞的高密度培養(yǎng)微載體，亦可用于組織工程中骨缺損的填充修復(fù)材料，作為組織工程中的可注射型細胞載體/水凝膠復(fù)合體用于對組織和器官缺損的修復(fù)和再生，具有非常好的應(yīng)用前景。
[0022]另外，本發(fā)明提供的中空開放明膠細胞微載體還可以通過層層自組裝的方法對其表面生物相容性進行進一步的改性，使其具有更好的生物降解性和細胞相容性。
【附圖說明】
[0023]圖1為本發(fā)明制備的重塑前的明膠蜂蠟微球的光鏡觀察圖。
[0024]圖2為本發(fā)明制備的重塑后的明膠蜂蠟微球光鏡觀察圖。
[0025]圖3為本發(fā)明制備的交聯(lián)后明膠蜂蠟微球光鏡觀察圖。
[0026]圖4為本發(fā)明制備的重塑前的明膠蜂蠟微球SEM觀察圖。
[0027]圖5為本發(fā)明制備的重塑后的明膠蜂蠟微球SEM觀察圖。
[0028]圖6為本發(fā)明制備的交聯(lián)后的明膠蜂蠟微球SM觀察圖。
[0029]圖7為本發(fā)明制備的中空開放明膠微載體的SEM觀察圖。
[0030]圖8為本發(fā)明中空開放明膠微載體上骨髓間充質(zhì)干細胞Dead/Live染色情況。
[0031]圖9為本發(fā)明填充細胞微載體一個月后的脛骨外觀圖。
[0032]圖10為本發(fā)明填充細胞微載體一個月后的脛骨HE染色圖。
【具體實施方式】
[0033]以下結(jié)合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。
[0034]除非特別說明，以下實施例所用試劑和材料均為市購。
[0035]實施例1本發(fā)明中空開放明膠細胞微載體的制備
1、制備方法
S1.雙乳法制備明膠蜂蠟微球
511.稱量4mg明膠，溶于40mL的純水中，加熱到80°C；
512.在700rpm轉(zhuǎn)速下，向Sll的明膠溶液中加入4mg的蜂錯，700rpm轉(zhuǎn)速下，攪拌5min ；
513.將S12得到的溶液倒入60°C預(yù)熱好的食用花生油中，400rpm轉(zhuǎn)15min；
514.將S13得到的溶液倒入_20°C預(yù)冷的冰乙醇中，靜置15min，然后用二氧六環(huán)/丙酮溶液清洗三次，放進60°