利用骨髓間充質(zhì)干細胞和/或多能干細胞的血中動員的組織再生促進劑的制作方法
【專利說明】利用骨髓間充質(zhì)干細胞和/或多能干細胞的血中動員的組 織再生促進劑
[0001] 本申請是申請日為2010年10月28日、發(fā)明名稱為"利用骨髓間充質(zhì)干細胞和/ 或多能干細胞的血中動員的組織再生促進劑"的中國申請?zhí)枮?01080059712. 0的分案申 請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及投予至與需要再生的組織不同的組織中的組織再生促進劑。
【背景技術(shù)】
[0003] 再生醫(yī)療是以損傷器官的功能性、器質(zhì)性再生為目的的醫(yī)療，其利用在體外進行 了培養(yǎng)和加工的細胞或組織。例如，皮膚培養(yǎng)片等是將在體外對從本人或他人采集的皮膚 細胞進行培養(yǎng)并加工成片狀的制品移植到損傷皮膚上。再生醫(yī)療中，為了確保治療所使用 的細胞，需要在體外對細胞進行培養(yǎng)增殖。通過培養(yǎng)操作，有可能會發(fā)生細胞的劣化（老 化、腫瘤化、細菌和病毒等的污染），因此為了維持安全性需要在保證GMP標(biāo)準的設(shè)施內(nèi)進 行制造，從而可預(yù)想到治療費用的高額化將成為課題。
[0004] 另一方面，已知生物體在器官損傷時具備損傷部位的修復(fù)再生機制，但損傷部位 很大時，非功能性的疤痕組織會占據(jù)損傷部位。帶有這種疤痕組織的損傷治愈在腦梗塞或 脊髄損傷中成為神經(jīng)再生的抑制因子、在心肌梗塞中成為心臟破裂的要因、在大面積燒傷 或手術(shù)創(chuàng)傷中變?yōu)榘毯鄹泶竦?、在生命預(yù)后、美容方面成為明顯損害QOL的原因。如果能夠 活化生物體所具有的損傷組織的修復(fù)再生機制，則可以期待在不發(fā)生疤痕治愈的情況下誘 導(dǎo)利用功能性組織的損傷組織（器官）的再生。
[0005] 已知在骨髄內(nèi)除了分化成白細胞或紅細胞等的造血干細胞之外，還存在能夠分化 成骨、軟骨、脂肪等的間充質(zhì)干細胞，近年來還得知存在能夠分化成上皮系或神經(jīng)系細胞的 多能干細胞。
[0006] 現(xiàn)有技術(shù)文獻
[0007] 專利文獻
[0008] 專利文獻 I :W02008/053892

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 發(fā)明要解決的技術(shù)問題
[0010] 在現(xiàn)有的治療方法中，對于治愈困難的大面積皮膚潰瘍、難治性骨折、腦梗塞等難 治性疾病，開發(fā)通過生理性修復(fù)再生機制的活化來誘導(dǎo)損傷組織的治愈的新型治療方法成 為課題。
[0011] 用于解決技術(shù)問題的方法
[0012] 在使用小鼠確認皮膚潰瘍部位治愈過程中HMGB-I及S100A8的將骨髓源性細胞 向皮膚潰瘍部的動員效果時可知：通過向相對于皮膚潰瘍部遠且不同位置的靜脈血內(nèi)投予 HMGB-I或S100A8,骨髓源性細胞被動員到皮膚潰瘍部位。接著，在確認HMGB-I及S100A8 的靜脈內(nèi)投予所產(chǎn)生的皮膚潰瘍治愈促進效果時顯示：通過將它們投予至距離潰瘍部位遠 且不同位置的血管內(nèi)，成功地促進了皮膚潰瘍的治愈。進而，在確認皮膚潰瘍的非疤痕性治 愈促進效果時顯示：通過將HMGB-I進行靜脈內(nèi)投予，可以促進已被動員至血液中的骨髓源 性細胞向潰瘍部分的進一步動員，從而可以促進皮膚潰瘍的早期閉合和非疤痕性治愈。
[0013] 另外，在確認腦梗塞模型小鼠腦中的骨髓源性細胞的存在時顯示：對于制作腦梗 塞后靜脈投予了 HMGB-I的小鼠，在腦內(nèi)確認到了表達神經(jīng)細胞標(biāo)記物的骨髓源性細胞。接 著，在確認腦梗塞灶的縮小效果時顯示：與對照小鼠相比，HMGB-I靜脈投予小鼠中，對于腦 梗塞灶確認到了顯著的改善效果。另外，在確認腦梗塞后的存活率改善時顯示：在HMGB-I 靜脈投予例中小鼠的存活率提高。
[0014] 進而，在使用小鼠確認在骨折治愈過程中骨折部以外部位的骨髓多能干細胞的相 關(guān)性時可知：損傷部位遠處的骨髓源性細胞移動至骨折部分進行損傷組織的修復(fù)。
[0015] 進而，使用骨折模型小鼠評價HMGBl靜脈投予所產(chǎn)生的骨髓間充質(zhì)干細胞向損傷 部位的動員活性時可知：通過HMGBl的靜脈內(nèi)投予，已被動員至血中的骨髓間充質(zhì)干細胞 聚集至骨折部分。
[0016] 本申請基于上述所知而提供以下的發(fā)明。
[0017] (1) 一種藥劑，其為含有以下（a)~（q)中任一項所述的物質(zhì)的組織再生促進劑， 且其被投予至與需要再生的組織不同的組織；
[0018] (a)HMGBl 蛋白質(zhì)
[0019] (b)分泌HMGBl蛋白質(zhì)的細胞
[0020] (c)插入有編碼HMGBl蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0021] (d)HMGB2 蛋白質(zhì)
[0022] (e)分泌HMGB2蛋白質(zhì)的細胞
[0023] (f)插入有編碼HMGB2蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0024] (g)HMGB3 蛋白質(zhì)
[0025] (h)分泌HMGB3蛋白質(zhì)的細胞
[0026] (i)插入有編碼HMGB3蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0027] (j)S100A8 蛋白質(zhì)
[0028] (k)分泌S100A8蛋白質(zhì)的細胞
[0029] (1)插入有編碼S100A8蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0030] (m)S100A9 蛋白質(zhì)
[0031] (η)分泌S100A9蛋白質(zhì)的細胞
[0032] (〇)插入有編碼S100A9蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0033] (ρ)細胞或組織的提取液
[0034] (q)細胞或組織的提取液的肝素結(jié)合級分。
[0035] (2)上述（1)所述的藥劑，其被非經(jīng)口投予。
[0036] (3)上述（2)所述的藥劑，其為注射投予。
[0037] (4)上述⑴所述的藥劑，其被投予至血管內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)或腹腔內(nèi)。
[0038] (5)上述（1)~（4)任一項所述的藥劑，其中，細胞或組織的提取液是通過包含將 細胞或組織浸漬在溶劑中的工序的方法來制造。
[0039] (6)上述⑴~⑷任一項所述的藥劑，其中，細胞或組織的提取液的肝素結(jié)合級 分是通過包含以下工序的方法來制造：
[0040] (a)將細胞或組織浸漬在溶劑中的工序、
[0041] (b)使工序（a)中獲得的提取液與固定化肝素接觸的工序、和
[0042] (C)從固定化肝素中洗脫肝素結(jié)合級分的工序。
[0043] (7)上述（1)~（6)任一項所述的藥劑，其被用于神經(jīng)組織、骨組織或皮膚組織的 再生促進。
[0044] (8) -種組織再生促進試劑盒，其包含含有以下（a)~（q)中任一項所述的物質(zhì)的 組合物，該組合物被投予至與需要再生的組織不同的組織；
[0045] (a)HMGBl 蛋白質(zhì)
[0046] (b)分泌HMGBl蛋白質(zhì)的細胞
[0047] (c)插入有編碼HMGBl蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0048] (d)HMGB2 蛋白質(zhì)
[0049] (e)分泌HMGB2蛋白質(zhì)的細胞
[0050] (f)插入有編碼HMGB2蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0051] (g)HMGB3 蛋白質(zhì)
[0052] (h)分泌HMGB3蛋白質(zhì)的細胞
[0053] ⑴插入有編碼HMGB3蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0054] (j)S100A8 蛋白質(zhì)
[0055] (k)分泌S100A8蛋白質(zhì)的細胞
[0056] (1)插入有編碼S100A8蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0057] (m)S100A9 蛋白質(zhì)
[0058] (η)分泌S100A9蛋白質(zhì)的細胞
[0059] (〇)插入有編碼S100A9蛋白質(zhì)的DNA的載體 [0060] (P)細胞或組織的提取液
[0061] (q)細胞或組織的提取液的肝素結(jié)合級分。
[0062] (9)上述⑶所述的試劑盒，其被非經(jīng)口投予。
[0063] (10)上述（9)所述的試劑盒，其為注射投予。
[0064] (11)上述⑶所述的試劑盒，其被投予至血管內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)或腹腔內(nèi)。
[0065] (12)上述⑶~（11)任一項所述的試劑盒，其被用于神經(jīng)組織、骨組織或皮膚組 織的再生促進。
[0066] (13) -種促進組織再生的方法，其包含：將有效量的含有以下（a)~（q)中任一 項所述的物質(zhì)的組合物投予至與需要再生的組織不同的組織的工序；
[0067] (a)HMGBl 蛋白質(zhì)
[0068] (b)分泌HMGBl蛋白質(zhì)的細胞
[0069] (c)插入有編碼HMGBl蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0070] (d)HMGB2 蛋白質(zhì)
[0071] (e)分泌HMGB2蛋白質(zhì)的細胞
[0072] (f)插入有編碼HMGB2蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0073] (g)HMGB3 蛋白質(zhì)
[0074] (h)分泌HMGB3蛋白質(zhì)的細胞
[0075] ⑴插入有編碼HMGB3蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0076] (j)S100A8 蛋白質(zhì)
[0077] (k)分泌S100A8蛋白質(zhì)的細胞
[0078] (1)插入有編碼S100A8蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0079] (m)S100A9 蛋白質(zhì)
[0080] (η)分泌S100A9蛋白質(zhì)的細胞
[0081] (〇)插入有編碼S100A9蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0082] (ρ)細胞或組織的提取液
[0083] (q)細胞或組織的提取液的肝素結(jié)合級分。
[0084] (14)上述（13)所述的方法，其中，為非經(jīng)口投予。
[0085] (15)上述（14)所述的方法，其中，為注射投予。
[0086] (16)上述（13)所述的方法，其中，向血管內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)或腹腔內(nèi)進行投 予。
[0087] (17)上述（13)~（16)任一項所述的方法，其促進神經(jīng)組織、骨組織或皮膚組織的 再生。
[0088] (18) -種含有以下（a)~（q)中任一項所述的物質(zhì)的組合物在組織再生促進劑的 制造中的用途，其中，該組織再生促進劑被投予至與需要再生的組織不同的組織；
[0089] (a)HMGBl 蛋白質(zhì)
[0090] (b)分泌HMGBl蛋白質(zhì)的細胞
[0091] (c)插入有編碼HMGBl蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0092] (d)HMGB2 蛋白質(zhì)
[0093] (e)分泌HMGB2蛋白質(zhì)的細胞
[0094] (f)插入有編碼HMGB2蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0095] (g)HMGB3 蛋白質(zhì)
[0096] (h)分泌HMGB3蛋白質(zhì)的細胞
[0097] (i)插入有編碼HMGB3蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0098] (j)S100A8 蛋白質(zhì)
[0099] (k)分泌S100A8蛋白質(zhì)的細胞
[0100] (1)插入有編碼S100A8蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0101] (m)S100A9 蛋白質(zhì)
[0102] (η)分泌S100A9蛋白質(zhì)的細胞
[0103] (〇)插入有編碼S100A9蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0104] (P)細胞或組織的提取液
[0105] (q)細胞或組織的提取液的肝素結(jié)合級分。
[0106] (19)上述（18)所述的用途，其中，所述組織再生促進劑被非經(jīng)口投予。
[0107] (20)上述（19)所述的用途，其中，為注射投予。
[0108] (21)上述（18)所述的用途，其中，所述組織再生促進劑被投予至血管內(nèi)、肌肉內(nèi)、 皮下、皮內(nèi)或腹腔內(nèi)。
[0109] (22)上述（18)~（21)任一項所述的用途，其中，所述組織再生促進劑為神經(jīng)組 織、骨組織或皮膚組織的再生促進劑。
[0110] (23) -種組合物，其為用于在促進組織再生的方法中使用的、含有以下（a)~（q) 中任一項所述的物質(zhì)的組合物，其被投予至與需要再生的組織不同的組織；
[0111] (a)HMGBl 蛋白質(zhì)
[0112] (b)分泌HMGBl蛋白質(zhì)的細胞
[0113] (c)插入有編碼HMGBl蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0114] (d)HMGB2 蛋白質(zhì)
[0115] (e)分泌HMGB2蛋白質(zhì)的細胞
[0116] (f)插入有編碼HMGB2蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0117] (g)HMGB3 蛋白質(zhì)
[0118] (h)分泌HMGB3蛋白質(zhì)的細胞
[0119] ⑴插入有編碼HMGB3蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0120] (j)S100A8 蛋白質(zhì)
[0121] (k)分泌S100A8蛋白質(zhì)的細胞
[0122] (1)插入有編碼S100A8蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0123] (m)S100A9 蛋白質(zhì)
[0124] (η)分泌S100A9蛋白質(zhì)的細胞
[0125] (〇)插入有編碼S100A9蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0126] (P)細胞或組織的提取液
[0127] (q)細胞或組織的提取液的肝素結(jié)合級分。
[0128] (24)上述（23)所述的組合物，其被非經(jīng)口投予。
[0129] (25)上述（24)所述的組合物，其中，為注射投予。
[0130] (26)上述（23)所述的組合物，其被投予至血管內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)或腹腔內(nèi)。
[0131] (27)上述（23)~（26)任一項所述的組合物，其中，促進組織再生的方法是促進神 經(jīng)組織、骨組織或皮膚組織的再生的方法。
[0132] 發(fā)明效果
[0133] 作為損傷組織再生藥品，已知HGF、EGF、VEGF、FGF等細胞增殖因子，但這些物質(zhì)是 被直接投予至損傷部位及其附近組織以期待促進細胞增殖來進行使用的。
[0134] HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8、S100A9具有動員骨髓多能干細胞的活性。骨髓多能 干細胞除了能分化成間充質(zhì)細胞之外，還可分化成上皮系或神經(jīng)系的細胞。在大面積的組 織損傷時，只要能夠介由血流將骨髓多能干細胞動員至損傷部位，則可期待促進骨髓多能 干細胞所帶來的生理性損傷組織的修復(fù)再生。
[0135] 通過本發(fā)明，提供了下述方法：通過利用靜脈內(nèi)投予等方法將作為骨髓多能干細 胞動員因子的HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8、S100A9投予至遠離損傷部位的遠處部位，從而 將骨髓多能干細胞動員至末梢血中，由此促進損傷組織修復(fù)。例如，在治療如腦梗塞那樣的 體內(nèi)深部器官的疾病時，很難將治療藥直接投予至損傷部位（腦）。而本發(fā)明中，由于使在 通常診療中廣泛實施的靜脈投予的治療成為可能，因而可以以任意的次數(shù)、濃度將治療藥 安全且簡便地投予，這是比現(xiàn)有的治療方法更優(yōu)異的效果。
[0136] 另外，作為最近開發(fā)出的使用了骨髄細胞的腦梗塞的治療方法，已知從患者本人 的骨髄采集細胞并再次投予到血液循環(huán)中的方法是有效的，但在采集骨髄細胞時由于需要 將很粗的針刺入體內(nèi)深部的骨髄進行抽吸，因而不可避免地伴有嚴重的侵襲。與此相對，在 本發(fā)明中，通過將藥劑進行靜脈內(nèi)投予，可以將骨髄細胞直接動員至血液循環(huán)中，因而即便 多次向腦梗塞患者投予，也不會伴有嚴重的侵襲。
[0137] 骨髄來源的多能干細胞具有分化成間充質(zhì)細胞、上皮系細胞、神經(jīng)系細胞等多種 細胞的潛在能力，認為在移動至損傷部位后根據(jù)周圍的微環(huán)境進行分化并誘導(dǎo)組織修復(fù)。 在再生醫(yī)療或細胞治療中，是在生物體外將稀少的骨髓多能干細胞進行培養(yǎng)并使其增殖 后用于治療，但與以往的藥品不同，由于具有在培養(yǎng)過程中可能發(fā)生的細胞的劣化（癌化 或細菌、病毒等的污染）的危險，因而需要充分的安全管理。本發(fā)明中，通過投予HMGB1、 HMGB2、HMGB3、S100A8、S100A9而將骨髓多能干細胞動員至末梢循環(huán)血內(nèi)，但由于不需要將 細胞取出至體外以施加人工操作，因而是安全性高的治療方法。
【附圖說明】
[0138] 圖1為表示HMGBl的純化過程的照片。將在HMGBl的N末端側(cè)含有利用GST-標(biāo) 簽6XHis-標(biāo)簽HRV3C獲得的剪切序列的表達載體轉(zhuǎn)染至HEK293。使培養(yǎng)上清結(jié)合于鎳柱， 用咪唑?qū)Y(jié)合級分進行洗脫。進而，將鎳柱結(jié)合級分利用HRV3C從HMGBl中剪切GST-標(biāo) 簽6XHis標(biāo)簽后，使其結(jié)合在肝素親和柱上，利用氯化鈉進行洗脫。使肝素結(jié)合級分結(jié)合在 Q柱上，利用氯化鈉進行洗脫。為了檢測各個純化過程的純化度，對結(jié)合在柱上的級分進行 SDS-PAGE后，進行考馬斯染色。
[0139] 圖2為表示潰瘍閉合后的皮膚和皮膚的薄切片的GFP信號的照片。在GFP骨髄移 植小鼠的背中制作皮膚潰瘍，經(jīng)靜脈投予HMGBl或S100A8。經(jīng)靜脈投予了 HMGBl和S100A8 的小鼠的皮膚上與對照相比，檢測到更多量的為GFP陽性的骨髓源性細胞。
[0140] 圖3為表示經(jīng)時測定的皮膚潰瘍面積的曲線。在小鼠的背中制作皮膚潰瘍，經(jīng)靜 脈投予HMGBl或S100A8。制作潰瘍后第3天，與對照組相比，在HMGBl投予組中可見皮膚 潰瘍的縮小效果。在制作潰瘍后第7天，與對照組相比，在S100A8投予組中可見皮膚潰瘍 的縮小效果（縱軸：潰瘍面積+皮膚潰瘍制作時的面積X 100,橫軸：皮膚潰瘍制作后的天 數(shù)）。
[0141] 圖4為表示皮膚潰瘍閉合后對皮膚的薄切片進行了蘇木精伊紅染色（HE)、Masson 三色染色（MT)后的結(jié)果的照片。在小鼠的背中制作皮膚潰瘍，經(jīng)靜脈投予HMGB1。在對照 小鼠中可見膠原纖維異常增加，而經(jīng)靜脈投予了 HMGBl的小鼠中抑制了膠原纖維的異常增 加。
[0142] 圖5為表示巢蛋白（神經(jīng)干細胞標(biāo)記物）和β III微管蛋白（神經(jīng)元標(biāo)記物）表 達細胞的檢測結(jié)果的照片。在GFP骨髄移植小鼠中制作腦梗塞，經(jīng)靜脈投予HMGBl來進行 治療。治療結(jié)束后，制作腦的薄切片進行免疫組織化學(xué)。左側(cè)照片的箭頭所示的細胞為GFP 陽性且巢蛋白陽性的細胞。右側(cè)照片的箭頭所示的細胞為GFP陽性且MII微管蛋白陽性 的細胞。確認了骨髄來源的細胞表達神經(jīng)標(biāo)記物。
[0143] 圖6為表示梗塞部位的檢測結(jié)果的照片。制作腦梗塞疾病模型小鼠，經(jīng)靜脈投予 HMGB1。治療結(jié)束后，制作腦的薄切片，進行尼氏染色。在PBS投予例（對照）中皮質(zhì)可見 壞死的組織，在HMGBl治療例中皮質(zhì)未見壞死的組織。
[0144] 圖7為表示腦梗塞制作后7天的存活率的曲線。制作腦梗塞疾病模型小鼠（缺血 45分鐘、缺血60分鐘）后，進行經(jīng)靜脈投予HMGBl所實施的治療。在缺血45分鐘、缺血60 分鐘的任一情況下，都確認了通過利用HMGBl的治療所帶來的存活率的改善。
[0145] 圖8為表示在通過皮膚結(jié)合的GFP骨髄移植小鼠和野生型小鼠中，GFP骨髄嵌合 體小鼠的骨髄細胞移動至野生型小鼠的右足骨折部位并分化成成骨細胞的照片。通過皮膚 將GFP骨髄移植小鼠和野生型小鼠結(jié)合、在野生型小鼠中制作骨折。在骨折部位的治愈后， 在表達骨鈣素的成骨細胞中存在GFP陽性細胞。教示了：在骨折的治愈過程中，距離損傷部 位遠的骨髓源性細胞移動至骨折部位并分化成成骨細胞，從而進行生理性損傷治愈。
[0146] 圖9為表示在向GFP骨髄移植小鼠背部移植皮膚后所觀察到的對移植皮膚片的 GFP熒光聚集的照片。上面左側(cè)的照片表示皮膚移植部的肉眼圖像、上面中央的照片表示在 移植皮膚與受體皮膚的邊界部（用"丨"表示的部分）附近處受體皮膚的HE組織圖像、上 面右側(cè)照片表示植皮皮膚的HE組織圖像。另外，下面左側(cè)照片表示對植皮皮膚的GFP熒光 的聚集、下面中央的照片表示植皮部的放大圖像、下面右側(cè)照片表示對該放大部皮膚的GFP 熒光的聚集。
[0147] 圖10為表示在GFP骨髄移植小鼠背部上的移植皮膚片中聚集的骨髄來源的表皮 細胞、骨髄來源的真皮成纖維細胞的照片。左側(cè)開始第1列是DAPI染色（核染色），上面 的照片表示植皮部皮膚的弱放大圖像（100倍）；中間照片以其強放大圖像（200倍）表示 表皮/真皮邊界部；下面以其強放大圖像（200倍）表示毛囊部。左側(cè)開始第2列表示第1 列的各個區(qū)域的GFP熒光圖像、左側(cè)開始第3列表示其角蛋白5 (K5)的免疫染色圖像、左側(cè) 開始第4列表示將各個熒光重疊后的圖像（Merge)。觀察到了多個GFP陽性表皮細胞和真 皮成纖維細胞。
[0148] 圖11為表示使用了 Boyden小室的皮膚提取液的骨髄來源間充質(zhì)干細胞迀移能力 活性測定結(jié)果的照片。上面左側(cè)照片是使用藍色色素對骨髓間充質(zhì)干細胞進行了染色的圖 像，所述骨髓間充質(zhì)干細胞從Boyden小室的上槽內(nèi)通過硅膜上的微孔迀移至皮膚提取液 側(cè)