新一代多功能抗體納米團簇的制備及其協同治療應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物技術領域，具體地說，是新一代多功能抗體納米團簇的制備及其 協同治療應用。
【背景技術】
[0002] 分子靶向治療是指針對參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的細胞信號轉導和其他生物學 途徑的治療手段。廣義的分子靶向治療的靶點包括了參與細胞分化、凋亡、迀移、侵襲性行 為、淋巴轉移、全身轉移等多過程的從DNA到蛋白水平的任何亞分子。本世紀以來，分子靶 向治療已成為腫瘤學研宄的熱點和主要方向，推動著腫瘤治療理念和理論的發(fā)展。利妥昔 單抗（Rituximab，C2B8,商品名美羅華）是第一個被FDA批準的以人⑶20分子為靶點治療 非霍奇金淋巴瘤的單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb)?，FRituximab+經典的CHOP 化療方案（環(huán)磷酰胺+阿霉素+長春新堿+潑尼松）已經成為CD20+非霍奇金淋巴瘤治療 的一線方案，在西方，幾乎所有的CD20+非霍奇金淋巴瘤患者在其病程中都會接受利妥昔 單抗的治療。隨后，抗體的靶向治療已成為目前抗腫瘤生物治療的主要手段。目前已有十 幾種抗體被FDA批準用于臨床治療。
[0003] 然而并非所有的患者對抗體的分子靶向治療都敏感。因此如何解決抗體的殺傷效 果及其臨床上表現出來的耐藥問題成為廣大科研和臨床工作者函待解決的主要問題。傳 統(tǒng)癌癥抗體治療方法雖然已取得了一些可觀的成效，但是徹底治愈和消除癌癥仍然是當前 社會醫(yī)療和人口健康的重大挑戰(zhàn)之一。例如，近年來，雖然NHL對傳統(tǒng)的放化療較敏感，約 48%的病人對Rituximab單抗治療產生不良反應，其余的患者盡管初次治療效果很好，但 經過一段時間的治療會出現繼發(fā)性耐藥，甚至復發(fā)。研宄表明CD20抗體主要通過補體依賴 的細胞毒作用（complement dependent cytotoxicity ;□)〇、抗體依賴的細胞介導的細胞 毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)、誘導腫瘤細胞細胞凋 亡三種機制殺傷腫瘤細胞。根據CD20抗體與靶細胞的CD20結合后的轉脂筏能力將其分為 兩型，I型抗體主要作用機制包括⑶C、ADCC，而誘導腫瘤細胞凋亡的能力很弱。II型抗體 主要作用機制包括ADCC、誘導腫瘤細胞凋亡，而⑶C作用很弱。此外，I型⑶20抗體在體外 與靶細胞的CD20結合后，再經過二抗的交聯，可以誘導靶細胞產生較強的凋亡。研宄表明， II型⑶20抗體誘導淋巴瘤細胞凋亡并不依賴于傳統(tǒng)的Caspase通路，而是依賴一條與溶酶 體相關的特殊途徑，而I型抗體交聯后誘導淋巴瘤細胞的凋亡依賴于傳統(tǒng)的Caspase通路。 然而，將CD20抗體進行交聯而誘導腫瘤細胞凋亡在體內情況下無法實現。
[0004] 基于納米技術的抗腫瘤治療給癌癥患者帶來新的希望，與傳統(tǒng)的抗體藥治療相 比，納米醫(yī)藥載體有以下幾個優(yōu)勢：體內較穩(wěn)定，對正常組織毒副作用低，可以實現藥物可 控釋放，提高生物利用度。然而，基于傳統(tǒng)納米載藥體系發(fā)展仍然不完善，受到體內外很大 因素限制，導致目前納米藥物治療的瓶頸問題：1，納米載體體內穩(wěn)定性差、循環(huán)時間短；2， 由于靶向性和穩(wěn)定性差，導致腫瘤內富集不足；3,腫瘤細胞靶向性及結合作用不強導致胞 吞少；4,胞內特定部位藥物釋放不可控的問題。
[0005] 納米醫(yī)學是將現代物理學、現代化學和先進工程技術與醫(yī)學相結合的一門邊緣學 科，其由于毒副作用低、治療效果好，在惡性腫瘤的預防及治療中發(fā)揮著越來越重要的作 用。本發(fā)明把納米技術與靶向治療抗體相結合，制備出新型的抗體納米團簇，擬為淋巴瘤的 治療提供新的方法和思路。
[0006] 本發(fā)明設計的新型抗體納米團簇，國內外尚未見類似的研宄報道。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明的目的是針對現有技術中的不足，提供新一代多功能抗體納米團簇。
[0008] 本發(fā)明的再一的目的是，提供新一代多功能抗體納米團簇的制備方法。
[0009] 本發(fā)明的另一的目的是，提供新一代多功能抗體納米團簇的協同治療功能。
[0010] 為實現上述目的，本發(fā)明采取的技術方案是：抗體納米團簇，所述的抗體納米團簇 由兩種或兩種以上的同一類型或不同類型的抗體通過鉸鏈偶聯到同一大分子鏈或球面上， 鏈接抗體和大分子鏈的鉸鏈劑分子包括可氧化還原降解，可水解，可酸解等可斷裂的化學 鍵，及不可斷裂的化學鍵。
[0011] 所述的抗體納米團簇的形態(tài)為鏈狀、球狀或棒狀，所述的抗體納米團簇的尺寸范 圍為0. 05-20 μL?，所述的分子鏈或球面的分子量為5000-100000g/mol。
[0012] 所述的抗體納米團簇還包括修飾其表面的PEG分子、溫敏高分子或pH值敏感等功 能高分子，所述的PEG分子的分子量為500-10000g/mol。
[0013] 所述舉例的抗體為抗⑶20抗體。
[0014] 所述的抗體為I型抗⑶20抗體與II型抗⑶20抗體。
[0015] 所述的I型抗⑶20抗體是Rituximab，所述的II型抗⑶20抗體是11B8。
[0016] 所述的抗體納米團簇以短鏈聚乙稀亞胺為載體，將I型抗⑶20抗體Rituximab與 II型抗⑶20抗體11B8在體外進行交聯制得。
[0017] 為實現上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術方案是：所述的抗體納米團簇的制備 方法包括以下步驟：
[0018] I) PEI溶液與MPEGS溶液反應制得MPEGS-PEI溶液，
[0019] 2)分別將Rituximab抗體和11B8抗體疏基化，
[0020] 3)巰基化的Rituximab抗體與巰基化的11B8抗體混合，再與MPEGS-PEI溶液反應 制得抗體納米團簇。
[0021] 為實現上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術方案是：所述的抗體納米團簇在制備 治療腫瘤（實體瘤及血液瘤）藥物中的應用。
[0022] 所述的腫瘤為淋巴瘤。
[0023] 本發(fā)明制備的抗CD20抗體納米團簇具有如下特點：
[0024] (1)、所述抗體納米團簇首次將兩種不同抗體在體外進行交聯并成功應用體內，解 決了 CD20抗體交聯在體內無法應用的科學難題。
[0025] (2)、所述抗體納米團簇在體外實驗中成功激活了目前已知的所有CD20抗體抗腫 瘤作用的四條通路，包括⑶C，ADCC，溶酶體介導的細胞凋亡以及caspases依賴的細胞凋亡 通路，在體內和體外實驗中表現出較強的腫瘤殺傷效果。
[0026] (3)、所述抗體納米團簇能夠結合不同腫瘤細胞表面的CD20抗原，引起淋巴瘤細 胞的同源聚集，增強其抗腫瘤作用。
[0027] (4)、所述抗體納米團簇與其來源抗體Rituximab、llB8相比具有更長的半衰期。
[0028] (5)、所述抗體納米團簇對臨床上對Rituximab耐藥的淋巴瘤細胞仍然具有較強 的殺傷作用。
[0029] (6)、所述抗體納米團簇能通過納米藥物增強的滲透與滯留效應（enhanced permeability and retention effect，EPR)以及抗原抗體的識別和結合效應，增強其在腫 瘤內部的富集能力。
【附圖說明】
[0030] 附圖1為抗⑶20抗體納米團簇構建示意圖。
[0031] 附圖2為抗⑶20抗體納米列針鑒定與表征分析。
[0032] 2A !SDS-PAGE鑒定抗CD20抗體納米團簇的成功構建。1-2 :PEI，3-4