脫細胞生物網(wǎng)膜的制備方法及由其制得的脫細胞生物網(wǎng)膜的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及組織工程與生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及脫細胞生物網(wǎng)膜的制備方法及由其制得的脫細胞生物網(wǎng)膜。
【背景技術(shù)】
[0002]細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)是結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白的復雜復合物，包含多種纖維蛋白，如膠原、纖維連接蛋白、層粘連蛋白、蛋白多糖等組分，其組分在不同物種間相對保守。細胞外基質(zhì)作為細胞生長支架，在細胞粘附、增殖和分化方面發(fā)揮著重要作用。在組織工程研宄領(lǐng)域，為了更好的模擬天然細胞外基質(zhì)的三維微環(huán)境，近年來，研宄人員開發(fā)了系列通過脫細胞技術(shù)得到脫細胞基質(zhì)生物支架材料的技術(shù)與方法。
[0003]脫細胞策略主要是指利用脫細胞技術(shù)(物理、化學、酶解等方法)去除組織中各種細胞成分以及遺傳物質(zhì)從而獲得天然生物支架材料。脫細胞基質(zhì)材料相對于傳統(tǒng)生物支架材料來說具有諸多優(yōu)勢，主要包括，I)細胞外基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)保留完整；2)天然細胞外基質(zhì)組成成分得以保留，利于細胞生長及功能發(fā)揮；3)脫細胞支架材料中含有天然細胞外基質(zhì)中的細胞因子和信號分子，可以增強細胞的功能并促進生物學功能；4)脫細胞過程能夠降低細胞外基質(zhì)免疫原性，利于異種來源的組織的治療性應(yīng)用，擴展了供體的來源；5)脫細胞基質(zhì)具有生物可降解性，不引發(fā)炎性反應(yīng)。正是由于以上優(yōu)勢，脫細胞基質(zhì)生物支架材料研宄近年來得到了國內(nèi)外研宄人員的廣泛關(guān)注并取得系列突破性進展，成功應(yīng)用于組織工程各個領(lǐng)域。目前，人們已經(jīng)能夠從多種組織中得到脫細胞基質(zhì)支架材料，如小腸、皮膚、血管、角膜以及更為復雜心、肺、肝、腎等。
[0004]大網(wǎng)膜是腹膜的一種，是存在于高等動物腹腔中的一層黏膜，是由結(jié)締組織形成的膜狀組織。大網(wǎng)膜是連接胃大彎至橫結(jié)腸的腹膜。大網(wǎng)膜富有極強的彈性以及高度血管化的結(jié)構(gòu)，這些優(yōu)點使其在組織工程與再生醫(yī)學領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用前景。目前，大網(wǎng)膜脫細胞相關(guān)研宄剛剛起步，還存在諸多問題亟待解決。由于大網(wǎng)膜組織的結(jié)構(gòu)和功能與皮膚、血管、瓣膜等組織存在較大差別，傳統(tǒng)的脫細胞方法，如反復凍融法、表面活性劑法、酶消化法等不能完全適用于大網(wǎng)膜組織的脫細胞處理。并且方法步驟繁瑣，成本高，不適用于批量制作。因此，目前需要開發(fā)一種能最大程度保留大網(wǎng)膜細胞外基質(zhì)組成與成分，且方法簡單，成本低廉的大網(wǎng)膜脫細胞方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種操作方法簡單、成本低廉的大網(wǎng)膜脫細胞方法。利用該方法得到大網(wǎng)膜脫細胞基質(zhì)能夠保留大網(wǎng)膜細胞外基質(zhì)組成與成分，具有良好的生物相容性。
[0006]根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了脫細胞生物網(wǎng)膜的制備方法，其包括使用含十二烷基硫酸鈉與DNA酶的緩沖液浸泡大網(wǎng)膜進行脫細胞處理的步驟。
[0007]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了脫細胞生物網(wǎng)膜的制備方法，其特征在于，按照如下操作步驟進行:
[0008](I)脫脂溶液的配制
[0009]將甲醇、氯仿與乙醚以體積比為1:1: 0.2-1的比例混勻；
[0010](2)脫細胞液的配制
[0011]I)脫細胞液1:稱取十二烷基硫酸鈉及DNA酶，溶解于磷酸鹽緩沖液中，其中，十二烷基硫酸鈉在磷酸鹽緩沖液中的濃度為1.5-3.5%重量比，DNA酶在磷酸鹽緩沖液中的濃度為 3500-4500U/L，pH 為 7.2-7.4，過濾除菌；
[0012]2)脫細胞液I1:稱取十二烷基硫酸鈉及DNA酶，溶解于磷酸鹽緩沖液中，其中，十二烷基硫酸鈉在磷酸鹽緩沖液中的濃度為0.6-1.5%重量比，DNA酶在PBS中的濃度為2500-3500U/L，pH 為 7.2-7.4，過濾除菌；
[0013]3)脫細胞液II1:稱取十二烷基硫酸鈉及DNA酶，溶解于磷酸鹽緩沖液中，其中，十二烷基硫酸鈉在磷酸鹽緩沖液中的濃度為0.1-0.6%重量比，DNA酶在PBS中的濃度為1500-2500U/L，pH 為 7.2-7.4，過濾除菌；
[0014](3)大網(wǎng)膜脫細胞處理
[0015]I)取新鮮的大網(wǎng)膜組織，于磷酸鹽緩沖液中清洗，將清洗后的組織震蕩浸泡于所述脫脂溶液中處理，脫脂溶液浸泡時間為18-30h，震蕩頻率為150-250r/min ；
[0016]2)將去除脂肪的所述大網(wǎng)膜組織于磷酸鹽緩沖液中清洗，并震蕩浸泡于所述脫細胞液I中處理，浸泡時間為4-12h，震蕩頻率為100-200r/min ；
[0017]3)將經(jīng)脫細胞液I處理后的所述大網(wǎng)膜組織于磷酸鹽緩沖液中清洗，并震蕩浸泡于脫細胞液II中處理，浸泡時間為4-12h，震蕩頻率為100-200r/min ；
[0018]4)將經(jīng)脫細胞液II處理后的大網(wǎng)膜組織于磷酸鹽緩沖液中清洗，并震蕩浸泡于所述脫細胞液III中處理，浸泡時間為4-12h，震蕩頻率為100-200r/min ；
[0019]5)將經(jīng)脫細胞液III處理后的所述大網(wǎng)膜組織經(jīng)冷凍干燥后滅菌。
[0020]本發(fā)明的方法采用梯度洗脫與物理震蕩相結(jié)合的方法對大網(wǎng)膜進行脫細胞處理，與現(xiàn)有的脫細胞方法相比，本發(fā)明的方法條件溫和，提高了大網(wǎng)膜脫細胞效率，同時最大程度的保留了大網(wǎng)膜脫細胞基質(zhì)的組成；本方法還具有操作簡單、可實施性強的優(yōu)點。
[0021]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了根據(jù)上述方法獲得的脫細胞生物網(wǎng)膜。
【附圖說明】
[0022]圖1脫細胞生物網(wǎng)膜I型膠原免疫組織化學染色X200。
[0023]圖2脫細胞生物網(wǎng)膜IV型膠原免疫組織化學染色X 200。
[0024]圖3脫細胞生物網(wǎng)膜纖維連接蛋白疫組織化學染色X200。
[0025]圖4脫細胞生物網(wǎng)膜彈性蛋白疫組織化學染色X200。
[0026]圖5天然大網(wǎng)膜組織與脫細胞生物網(wǎng)膜中的DNA含量檢測(*p < 0.01)。
【具體實施方式】
[0027]在本申請中，縮寫詞的含義如下:
[0028]SDS:十二烷基硫酸鈉；
[0029]PBS:磷酸鹽緩沖液；
[0030]DNA酶:脫氧核糖核酸酶；
[0031]min:分鐘。
[0032]根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了脫細胞生物網(wǎng)膜的制備方法，其包括使用含十二烷基硫酸鈉與DNA酶的緩沖液浸泡大網(wǎng)膜進行脫細胞處理的步驟。
[0033]在某些實施方案中，在進行脫細胞處理的步驟中還進行震蕩。
[0034]在某些實施方案中，還包括脫脂處理的步驟。在示例性實施方案中，脫脂處理的步驟在脫細胞處理的步驟之前進行。在某些優(yōu)選的實施方案中，該脫脂處理的步驟使用體積比為1:1: 0.2-1的甲醇、氯仿和乙醚的混合溶液進行。在某些更優(yōu)選的實施方案中，甲醇、氯仿和乙醚的體積比為1:1: 0.4-0.7。在最優(yōu)選的實施方案中，甲醇、氯仿和乙醚的體積比為1:1: 0.5。
[0035]在某些實施方案中，脫細胞處理的步驟是分梯度進行的，所述梯度包括至少第一梯度和第二梯度。
[0036]在某些優(yōu)選的實施方案中，在第一梯度中，十二烷基硫酸鈉的濃度為1.5-3.5%重量比，DNA酶的濃度為3500-4500U/L，pH為7.2-7.4。在某些更優(yōu)選的實施方案中，在第一梯度中，十二烷基硫酸鈉的濃度為1.5-2.5%重量比，DNA酶的濃度為3600-4400U/L。在某些更優(yōu)選的實施方案中，在第一梯度中，十二烷基硫酸鈉的濃度為1.8-2.2%重量比，DNA酶的濃度為3800-4200U/L。在最優(yōu)選的實施方案中，在第一梯度中，十二烷基硫酸鈉的濃度為2.0 %重量比，DNA酶的濃度為4000U/L。
[0037]在某些優(yōu)選的實施方案中，在第二梯度中，十二烷基硫酸鈉的濃度為0.6-1.5%重量比，DNA酶的濃度為2500-3500U/L，pH為7.2-7.4。在某些更優(yōu)選的實施方案中，在第二梯度中，十二烷基硫酸鈉的濃度為0.7-1.3%重量比，DNA酶的濃度為2600-3400U/L。在某些更優(yōu)選的實施方案中，在第二梯度中，十二烷基硫酸鈉的濃度為0.8-1.2%重量比，DNA酶的濃度為2800-3200U/L。在最優(yōu)選的實施方案中，在第二梯度中，十二烷基硫酸鈉的濃度為1.0 %重量比，DNA酶的濃度為3000U/L。
[0038]在某些優(yōu)選的實施方案中，所述梯度還包括第三梯度，其中在所述第三梯度中，十二烷基硫酸鈉的濃度為0.1-0.6%重量比，DNA酶的濃度為1500-2500U/L，pH為7.2-7.4。在某些更優(yōu)選的實施方案中，在第三梯度中，十二烷基硫酸鈉的濃度為0.2-0.6%重量比，DNA酶的濃度為1600-2400U/L。在某些更優(yōu)選的實施方案中，在第三梯度中，十二烷基硫酸鈉的濃度為0.4-0.6%重量比，DNA酶的濃度為1800-2200U/L。在最優(yōu)選的實施方案中，在第三梯度中，十二烷基硫酸鈉的濃度為0.5%重量比，DNA酶的濃度為2000U/L。
[0039]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了脫細胞生物網(wǎng)膜的制備方法，其特征在于，按照如下操作步驟進行:
[0040](I)脫脂溶液的配制
[0041]將甲醇、氯仿與乙醚以體積比為1:1: 0.2-1的比例混勻；
[0042](2)脫細胞液的配制
[0043]I)脫細胞液1:稱取十二烷基硫酸鈉及DNA酶，溶解于磷酸鹽緩沖液中，其中，十二烷基硫酸鈉在磷酸鹽緩沖液中的濃度為1.5-3.5%重量比，DNA酶在磷酸鹽緩沖液中的濃度為 3500-4500U/L，pH 為 7.2-7.4，過濾除菌；
[0044]2)脫細胞液I1:稱取十二烷基硫酸鈉及DNA酶，溶解于磷酸鹽緩沖液中，其中，十二烷基硫酸鈉在磷酸鹽緩沖液中的濃度為0.6-1.5%重量比，DNA酶在PBS中的濃度為2500-3500U/L，pH 為 7.2-7.4，過濾除菌；
[0045]3)脫細胞液II1:稱取十二烷基硫酸鈉及DNA酶，溶解于磷酸鹽緩沖液中，其中，十二烷基硫酸鈉在磷酸鹽緩沖液中的濃度為0.1-0.6%重量比，DNA酶在PBS中的濃度為1500-2500U/L，pH 為 7.2-7.4，過濾除菌；
[0046](3)大網(wǎng)膜脫細胞處理
[0047]I)取新鮮的大網(wǎng)膜組織，于磷酸鹽緩沖液中清洗，將清洗后的組織震蕩浸泡于所述脫脂溶液中處理，脫脂溶液浸泡時間為18-30h，震蕩頻率為150-250r