一種具有內(nèi)置營養(yǎng)通道的三維生物結(jié)構(gòu)的打印方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于組織工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種具有內(nèi)置營養(yǎng)通道的三維生物結(jié)構(gòu)的打印方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，全球每年等待器官移植的患者數(shù)量驚人。美國每年有超過6500人因未能及時(shí)得到捐贈的器官而死亡。此外，即便得到了捐贈的器官，患者在接受移植技術(shù)后也會出現(xiàn)不同程度的排異反應(yīng)。目前有兩種制作器官的主要方法，一是利用組織工程的思路，打印支架然后在支架內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞，二是利用細(xì)胞直接打印構(gòu)成器官。
[0003]目前基于組織工程技術(shù)制作器官的思路是先制作多孔支架然后在支架內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞，最后將其移植到生物體內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)。但組織工程方法難以解決細(xì)胞的密度問題，且細(xì)胞是在支架表面上生長，而真實(shí)的細(xì)胞生長環(huán)境是三維的，更重要的是表面的細(xì)胞可以得到更多的營養(yǎng)，內(nèi)層細(xì)胞營養(yǎng)不良。
[0004]因而目前器官打印技術(shù)又稱之為細(xì)胞打印技術(shù)開始逐漸成為生物器官制造的研宄熱點(diǎn)。將細(xì)胞混合營養(yǎng)液作為生物材料，利用3D打印技術(shù)構(gòu)造出實(shí)體器官，然后再進(jìn)一步進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)便可獲得具備生物活性的組織結(jié)構(gòu)。從長遠(yuǎn)看可以解決人體器官短缺的難題，目前而言也可為高通量藥物篩選、生物醫(yī)學(xué)機(jī)理研宄等提供更為有效的手段。對一個(gè)活性組織而言，器官內(nèi)遍布的各類血管是器官保持活性的根本，各類血管組成的是一個(gè)立體的流道網(wǎng)絡(luò)，只有有效的加工出和試劑生物器官相似的流道網(wǎng)絡(luò)才有可能實(shí)現(xiàn)營養(yǎng)的有效輸送，避免外層細(xì)胞營養(yǎng)過剩，內(nèi)層細(xì)胞營養(yǎng)不良，確保打印出的細(xì)胞能在后續(xù)的培養(yǎng)中形成一個(gè)真正的活性器官。因而探索在打印同時(shí)實(shí)現(xiàn)支架/結(jié)構(gòu)內(nèi)的流道網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建是活性支架打印的核心。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]鑒于現(xiàn)有技術(shù)無法很好地實(shí)現(xiàn)打印過程中凝膠內(nèi)營養(yǎng)通道的構(gòu)建，為了提高生物打印中細(xì)胞的活性，本發(fā)明提供了一種具有內(nèi)置營養(yǎng)通道的三維生物結(jié)構(gòu)的打印方法，利用三維打印裝置，通過控制打印過程中的工藝參數(shù)，使形成的中空凝膠纖維未完全反應(yīng)，沒有完全反應(yīng)的凝膠先驅(qū)材料可以融合成一體，最終得到所需要的三維生物結(jié)構(gòu)。
[0006]具體方案分別如下:
[0007]—種具有內(nèi)置營養(yǎng)通道的三維生物結(jié)構(gòu)的打印方法，包括:利用三維打印裝置打印含有細(xì)胞的中空凝膠纖維，通過控制打印過程中的工藝參數(shù)，使得打印出的含有細(xì)胞的中空凝膠纖維未完全反應(yīng)，保證相鄰兩個(gè)中空凝膠纖維之間能夠融合，打印完成后，使得所有含有細(xì)胞的中空凝膠纖維反應(yīng)完全，得到具有內(nèi)置營養(yǎng)通道的三維生物結(jié)構(gòu)。
[0008]作為優(yōu)選，所述打印方法的具體步驟為:
[0009](I)制備凝膠先去材料水溶液和凝膠交聯(lián)水溶液；
[0010]制備凝膠先驅(qū)材料水溶液時(shí)，具體操作步驟為:將滅菌后的凝膠先驅(qū)材料和去離子水混合，制備成一定濃度的凝膠材料水溶液。這里所用的凝膠先驅(qū)材料一般是離子敏感材料，包括海藻酸鈉、殼聚糖等。作為優(yōu)選，凝膠先驅(qū)材料選擇為海藻酸鈉，其來源廣泛，生物兼容性好。
[0011]制備凝膠交聯(lián)劑水溶液時(shí)，需要根據(jù)不同的凝膠先驅(qū)材料提供相應(yīng)的觸發(fā)條件，使其發(fā)生化學(xué)反應(yīng)形成凝膠，形成具有一定強(qiáng)度的包含細(xì)胞的中空凝膠纖維。這里所述的觸發(fā)條件一般是一種離子溶液，稱為凝膠交聯(lián)劑，例如海藻酸鈉對應(yīng)著氯化鈣溶液，殼聚糖對應(yīng)著氫氧化鈉溶液。作為優(yōu)選，凝膠交聯(lián)劑選擇為氯化鈣溶液，其與海藻酸鈉反應(yīng)，產(chǎn)物為海藻酸鈣，形成的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度較高；
[0012](2)選定所需細(xì)胞，培養(yǎng)后與凝膠先驅(qū)材料配制的溶液混合均勻，制備得到溶液細(xì)胞的混合物；本步驟中，細(xì)胞的種類需要根據(jù)實(shí)際需要的生物要求確定，細(xì)胞的濃度要根據(jù)目標(biāo)組織器官的要求確定。
[0013](3)將溶液細(xì)胞的混合物加入到與外噴頭相連的注射器中；將所述凝膠交聯(lián)劑水溶液加入到與內(nèi)噴頭相連的注射器中；所述外噴頭和內(nèi)噴頭同軸設(shè)置，所述內(nèi)噴頭的出料端伸入外噴頭的噴腔內(nèi)且繼續(xù)延伸至于外噴頭的出料端平齊；
[0014]外噴頭和內(nèi)噴頭組成整體的同軸噴頭，通過將兩個(gè)注射器均放置在雙通道注射泵上，利用注射泵實(shí)現(xiàn)對外噴頭和內(nèi)噴頭流量的控制；
[0015](4)設(shè)置外噴頭和內(nèi)噴頭的出料速度、運(yùn)行參數(shù)，控制外噴頭和內(nèi)噴頭按照設(shè)定軌跡打印，得到未完全反應(yīng)的中空凝膠纖維，且相鄰中空凝膠纖維線與線之間融合在一起，完成第一層的打印，i = l;
[0016]外噴頭和內(nèi)噴頭的出料速度主要利用雙通道注射泵控制，以保證得到含有細(xì)胞的未完全反應(yīng)的中空凝膠纖維；
[0017]運(yùn)行參數(shù)一般是指同軸噴頭的運(yùn)行速度和軌跡等，這些參數(shù)均可通過三維打印裝置直接控制；
[0018]一般情況下，同軸噴頭將物料打印至成形平臺上，成形平臺在Z軸驅(qū)動機(jī)構(gòu)的驅(qū)動下科研z軸運(yùn)動；同軸噴頭一般與X軸驅(qū)動機(jī)構(gòu)和Y軸驅(qū)動機(jī)構(gòu)連接，通過X軸驅(qū)動機(jī)構(gòu)和Y軸驅(qū)動機(jī)構(gòu)可分別實(shí)現(xiàn)同軸噴頭沿X軸方向的移動和沿I軸方向的移動；
[0019]通過控制中空凝膠纖維線與線之間的距離，保證未完全反應(yīng)的相鄰中空凝膠纖維相互融合；
[0020](5)以相同的方法在第i層上打印第i+Ι層，第i層和第i+Ι層層與層接觸部位相互融合；第i層和第i+ι層均未完全反應(yīng)，保證層與層之間的融合；
[0021](6)第i層和第i+Ι層打印完成后，利用控制系統(tǒng)，控制第i層下降，使打印完成的第i層浸泡在凝膠交聯(lián)劑水溶液中充分反應(yīng)，并使打印完成的第i+ι層暴露在凝膠交聯(lián)劑水溶液液面外；
[0022]該步驟中，通過驅(qū)動成形平臺下降，即可實(shí)現(xiàn)對第i層的下降；使打印完成的第一層浸泡在凝膠交聯(lián)劑水溶液(例如氯化鈣溶液)中充分反應(yīng)，并使打印完成的第二層依然暴露在凝膠交聯(lián)劑水溶液液面外；
[0023](7)令i = i+Ι，重復(fù)步驟(5)和步驟￠)，始終保持最上面兩層在融合，下面的層在充分反應(yīng)，直至打印完成，將整個(gè)結(jié)構(gòu)完全浸泡在凝膠交聯(lián)劑水溶液中，完全反應(yīng)后得到具有內(nèi)置營養(yǎng)通道的三維生物結(jié)構(gòu)。
[0024]以海藻酸鈉和氯化鈣的組合為例，步驟(4)中得到含有細(xì)胞的未完全反應(yīng)的中空凝膠纖維的原理為:由同軸噴頭外噴頭流出的海藻酸鈉溶液與同軸噴頭內(nèi)噴頭流出的氯化鈣溶液接觸，表面先發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，形成一層海藻酸鈣凝膠，這層海藻酸鈣凝膠使海藻酸鈉和氯化鈣溶液分離在兩側(cè)，由于形成的凝膠層的孔隙很小，只能允許鈣離子通過，不允許海藻酸離子通過，所以內(nèi)層的鈣離子穿過凝膠層與外面的海藻酸鈉繼續(xù)反應(yīng)，直到鈣離子完全反應(yīng)，海藻酸鈉沒有完全反應(yīng)，最終形成外部實(shí)心部分為包含細(xì)胞的海藻酸鈣凝膠和未完全反應(yīng)的包含細(xì)胞的海藻酸鈉，內(nèi)部中空部分為水溶液的中空凝膠纖維。根據(jù)這個(gè)原理，要得到包含細(xì)胞的未完全反應(yīng)的中空凝膠纖維，需要嚴(yán)格控制步驟(I)中海藻酸鈉溶液濃度、步驟(I)中氯化鈣溶液濃度、步驟(4)-(7)中的海藻酸鈉流速和氯化鈣溶液流速這四個(gè)工藝參數(shù)的組合。
[0025]以海藻酸鈉和氯化鈣的組合為例，步驟(5)中含有細(xì)胞的中空凝膠纖維融合在一起的原理為:中空凝膠纖維實(shí)心部分的外層為未完全反應(yīng)的海藻酸鈉，成溶膠態(tài)，這樣相鄰的線與線或?qū)优c層之間未反應(yīng)的海藻酸鈉便可以融合為一體。根據(jù)這個(gè)原理，要使相鄰的中空凝膠纖維線與線或?qū)优c層融合在一起，需要根據(jù)中空凝膠纖維徑向尺寸嚴(yán)格控制線與線和層與層之間的距離，這就要求控制系統(tǒng)在生成代碼信息時(shí)，根據(jù)不同的工藝參數(shù)設(shè)置好合適的線距和層高。
[0026]作為優(yōu)選，所述凝膠先驅(qū)材料為海藻酸鈉或殼聚糖；所述凝膠交聯(lián)劑為氯化鈣或氫氧化鈉。打印過程中材料的濃度及流速的優(yōu)選方案:所述凝膠先驅(qū)材料水溶液的質(zhì)量百分比濃度為2% -4%，流速為0.5-1.5ml/min ;所述凝膠交聯(lián)劑水溶液的質(zhì)量百分比濃度為2% _4%，流速為l-4ml/min。選擇該技術(shù)方案是時(shí)，打印得到的三維生物結(jié)構(gòu)的強(qiáng)度較好。
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