一種金針菇抗腫瘤水溶性組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食用菌功效成分的提取制備方法，具體涉及一種金針菇抗腫瘤水溶性 組合物的制作方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 當(dāng)前，癌癥已成為人類死亡的前兩位原因之一，嚴(yán)重危害著人類的身心健康，雖然 經(jīng)過這么多年的努力，人類在與癌癥的斗爭中已取得了 一些可喜成績，但要真正攻克癌癥 則還有很長的路要走。而近年來，越來越多的專家、學(xué)者們將目光轉(zhuǎn)到天然產(chǎn)物上，特別是 食藥用菌上，從中找尋可以用于治療癌癥、減輕腫瘤放化療毒副作用或增強(qiáng)機(jī)體免疫等功 效的成分，以之為原料開發(fā)抗腫瘤藥品或保健食品，給人類的健康事業(yè)帶來福音。
[0003] 金針葫[Flammulina velutipes (Curt. :Fr.) Sing.]又名冬葫、樸葫、金葫、智力葫 等，隸屬擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina)、層菌綱（Hymenomycetes)、傘菌目（Agaricales)、 口蘑科（Tricholomatacea)、金錢菌屬（Flammulina)。是目前人工栽培較為廣泛的食用菌 之一，在國際市場上產(chǎn)量居食用菌前三位?，F(xiàn)代藥理研宄表明，金針菇中的多糖、三萜、蛋 白、核酸等成分，具有免疫調(diào)節(jié)，抗腫瘤、抗病毒、保肝等功效，日益成為保健品和功能性食 品等行業(yè)研宄的熱點(diǎn)。早在上個(gè)世紀(jì)60年代，就有日本學(xué)者報(bào)道金針菇多糖對(duì)小鼠荷S180 有明顯的抑制作用，隨后越來越多的研宄證實(shí)金針菇有較好的抑制腫瘤作用和免疫調(diào)節(jié)作 用，其抗腫瘤作用機(jī)理主要是通過免疫調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)的。
[0004] 中國專利CN 102416025 B《金針菇抗腫瘤有效組分提取物及其制法和用途》中， 采用乙醇提取金針菇中的脂溶性成分，經(jīng)溶劑萃取后得到具有抗腫瘤作用的金針菇脂溶性 提取物，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該提取物部位可以明顯抑制人肝癌細(xì)胞（HepG2)的增殖， 具有細(xì)胞毒作用。
[0005] 中國專利CN 103054908 A《金針菇中具有抗腫瘤作用的不皂化提取物及其制法 和用途》中，采用乙醇提取金針菇子實(shí)體，提取物經(jīng)萃取、皂化、再萃取得到具有抗腫瘤作用 的不皂化提取物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該不皂化提取物具有體外抑制人肝癌（HepG2)、人胃腺癌 (SGC)、人膠質(zhì)癌（U251)、人肺腺癌（A549)細(xì)胞生長的活性。
[0006] 中國專利CN 103272214 A《金針菇蛋白質(zhì)提取物及其抗腫瘤的應(yīng)用》中，金針菇子 實(shí)體粉碎后，用水浸提，提取液經(jīng)硫酸銨等電點(diǎn)沉淀和透析純化后，得到金針菇蛋白質(zhì)提取 物。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，該提取物對(duì)人肝癌（HepG2)、人乳腺癌（MCF-7)、人肺腺癌（A-549) 細(xì)胞均有顯著的抑制增殖作用，IC 5tl值皆為8 μ g/mL，該提取物可用于制備抗腫瘤或腫瘤細(xì) 胞的產(chǎn)品。
[0007] 以上是目前國內(nèi)關(guān)于金針菇抗腫瘤方面的專利，主要是金針菇中的脂溶性成分或 水溶性成分中的蛋白質(zhì)類物質(zhì)，而對(duì)于水溶性成分中的其他物質(zhì)，如多糖、多肽和核酸等并 未涉及，整個(gè)的金針菇水溶性組合物也未涉及。
[0008] 除了專利之外，文獻(xiàn)中對(duì)金針菇的抗腫瘤作用也多有報(bào)道，但研宄的重點(diǎn)均是金 針菇水提物中的多糖部分，其他如蛋白、三萜等則沒有報(bào)道。趙坤等對(duì)金針菇菌絲體進(jìn)行研 宄，發(fā)現(xiàn)其菌絲體多糖具有較好的抑制人肝癌（Bel-7402)細(xì)胞作用。常花蕾等通過實(shí)驗(yàn)證 明，金針菇多糖（FVP)對(duì)小鼠 S180肉瘤、小鼠腹水型肝細(xì)胞H22有抑制作用，對(duì)治療卵巢癌 和乳腺癌都有較好療效。陳芝蕓等報(bào)道，金針菇多糖（FVPl)對(duì)Lewis肺癌實(shí)體瘤的生長和 自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移有明顯的抑制作用，并能增強(qiáng)和恢復(fù)Lewis荷瘤小鼠的免疫功能。吳希哲等 報(bào)道，金針菇提取物（FVE)可以抑制Heps腫瘤細(xì)胞的增值作用，并對(duì)肝臟損傷有一定的保 護(hù)作用。鄒宇曉等的研宄表明，粗多糖CFVP、脫蛋白多糖DCFVP、單一多糖組分FVP23個(gè)金 針菇多糖在體外均有不同的抑制腫瘤增殖作用，它們對(duì)人肝癌細(xì)胞H印G-2的IC 5tl分別為 396. 6、1000、719. 7 μ g/mL，該研宄結(jié)果表明未經(jīng)純化處理的金針菇多糖的抗腫瘤活性比純 化處理的好。
[0009] 通過以上專利和文獻(xiàn)的調(diào)研可以看出，金針菇具有一定的抗腫瘤功效，其中包括 脂溶性成分中三萜和不皂化物質(zhì)、水溶性成分蛋白和多糖等，都有不同程度的腫瘤抑制作 用。然而，這些報(bào)道中，有些是經(jīng)過簡單的提取，未經(jīng)任何步驟純化，直接拿粗提物去做藥理 研宄，藥效不是很理想；有些則是提取之后經(jīng)復(fù)雜的分離純化得到較純的某一類成分，再進(jìn) 行藥理研宄，結(jié)果是有的純化成分的藥效提高了，但復(fù)雜的純化工藝成本較高；有的純化成 分的藥效反而降低了?，F(xiàn)代的藥理研宄表明，天然產(chǎn)物中的一些中草藥和食藥用菌，都有較 好的抑制腫瘤作用，但具體的作用機(jī)理或者是何種物質(zhì)在起作用至今困擾著我們，研宄者 們發(fā)現(xiàn)，真正有較好抑瘤作用的反而是一些復(fù)合成分的組合物，單一的成分反而效果不好。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明目的是提供一種工藝簡單、高效環(huán)保的金針菇抗腫瘤水溶性組合物的制備 方法。
[0011] 本發(fā)明的技術(shù)方案為一種金針菇抗腫瘤水溶性組合物的制作方法，其要點(diǎn)在于它 是將鮮金針菇子實(shí)體，加水、加熱浸提，冷卻、過濾得粗提液，粗提液經(jīng)膜分離，收集陶瓷膜 和超濾膜之間的截留部位，再經(jīng)樹脂脫色除雜后，收集洗脫液，并進(jìn)行濃縮、干燥，得到抗腫 瘤水溶性組合物。
[0012] 具體而言一種制備上述金針菇抗腫瘤水溶性組合物的方法，包括如下步驟： 步驟1 :鮮金針菇子實(shí)體，按重量，加水，固液比為1:2-6,加熱到85~100°C，常壓下 浸提l_3h，冷卻到室溫，80-200目過濾，濾渣再以上述比例及條件重復(fù)提取一遍，冷卻到室 溫，80-200目過濾，合并兩次濾液即為粗提液； 步驟2 :將步驟1得到的粗提液作為母液，經(jīng)陶瓷膜分離，濾過液再經(jīng)超濾膜分離，陶 瓷膜的孔徑為〇. 05-1 μ m，超濾膜的孔徑為5-20nm，得到陶瓷膜和超濾膜之間的截留液；步 驟3 :將步驟2得到的截留液，濃縮至濃度為10~30mg/mL，經(jīng)填充有樹脂的層析柱脫色純 化，按體積，液固比為20-50: 1，用純化水為洗脫液，對(duì)樹脂進(jìn)行洗脫，至洗脫液吸光值不變 為止，收集洗脫液，并進(jìn)行濃縮、干燥，最終得到抗腫瘤水溶性組合物。
[0013] 現(xiàn)有技術(shù)中有將金針菇的粗提液單獨(dú)經(jīng)膜分離或樹脂脫色除雜形成產(chǎn)品，并未見 報(bào)道將二者結(jié)合起來進(jìn)行純化。本發(fā)明將二者結(jié)合起來，分離純化得到的水溶性組合物經(jīng) 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有很好的抑制作用。
[0014] 還可進(jìn)一步將各個(gè)參數(shù)具體為： 所述步驟1中，固液比為1 :3_5,提取溫度為90_100°C。
[0015] 所述步驟2中，膜分離孔徑分別為：陶瓷膜的孔徑為0. 1-0. 5 μπι，超濾膜的孔徑為 5_10nm〇
[0016] 所述步驟2中，陶瓷膜和超濾膜之間的截留液濃縮至濃度為15-20mg/mL，樹脂柱 層析中液固比為25-35:1。
[0017] 所述的樹脂為DEAE-52纖維素樹脂或DEAE S印harose Fast Flow (DEAE-FF)纖維 素樹脂。
[0018] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了金針菇抗腫瘤水溶性組合物在制備抗腫瘤藥物或保健食品、 特殊醫(yī)學(xué)配方食品領(lǐng)域中的應(yīng)用。通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抗腫瘤水溶性組合物（FVE)，對(duì) 人結(jié)腸癌（HCT-8)、人肝癌〇fepG2)、人胃癌（BGC-803)和人鼻咽癌（KB)腫瘤細(xì)胞都具有良 好的抑制作用，尤其對(duì)于H印G2和KB的作用最為明顯，IC 5tl分別為I. 0和0. 8 μ g/mL。
[0019] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：1、采用傳統(tǒng)的膜分離法和DEAE-52 (或DEAE-FF)樹脂脫色對(duì) 金針菇水提取液進(jìn)行純化，得到具有抑瘤作用的水溶性組合物，這水溶性組合物同時(shí)含有 水溶性多糖、蛋白和核酸等物質(zhì)。整個(gè)分離過程不帶入任何有機(jī)溶劑，消除了有機(jī)溶劑對(duì)環(huán) 境的污染；膜分離過程和DEAE-52樹脂脫色，可以最大限度地保持被分離物質(zhì)的生物活性， 工藝簡便、高效環(huán)保。
[0020] 2、經(jīng)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，得到的金針菇水溶性組