可復(fù)制型雙質(zhì)?？鼓I癌dna疫苗及其構(gòu)建方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，涉及一種抗腎癌雙質(zhì)粒可復(fù)制型DNA疫苗及其構(gòu)建方 法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腎細(xì)胞癌是成人腎臟腫瘤中最常見的一種類型，大約占到成人惡性腫瘤的3%，占 所有腎臟腫瘤的80%，是泌尿系腫瘤中致死率最高一種腫瘤。當(dāng)腫瘤組織局限在腎實(shí)質(zhì)時(shí)， 腎細(xì)胞癌的預(yù)后相對(duì)較好，5年生存率為70-80%，對(duì)于這類病例，部分或根治性手術(shù)是主 要的治愈性治療方式。然而當(dāng)腫瘤組織發(fā)生局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，即進(jìn)展為轉(zhuǎn)移性腎癌時(shí)，預(yù)后 就相對(duì)較差。這是因?yàn)槟I細(xì)胞癌是一種"惰性腫瘤"，對(duì)一些傳統(tǒng)的治療方式，比如化療和 放療都不敏感，IFN和IL-2細(xì)胞因子治療后中位生存期也只有13個(gè)月，沒有獲得理想的療 效，預(yù)后相對(duì)較差。臨床上20-30%的腎癌患者在初次診斷時(shí)已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移，并且大約有 三分之一的局限性腎癌患者最終進(jìn)展為轉(zhuǎn)移性腎癌。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF)和雷帕霉 素靶蛋白（mTOR)信號(hào)通路靶向藥物的出現(xiàn)，為醫(yī)生和患者提供了的新治療選擇。然而這些 藥物的治療效果也存在一定的局限性，有相當(dāng)一部分的患者服用這類靶向藥物后沒有獲得 相應(yīng)的臨床預(yù)期效果。同時(shí)，這類藥物也存在費(fèi)用昂貴、有短期和長(zhǎng)期毒性等缺點(diǎn)。因此， 傳統(tǒng)的治療方法在克服腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移方面有很大的局限性，成為腫瘤治療的瓶頸。對(duì)于 轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌的治療仍然是一個(gè)棘手的問題，仍然需要進(jìn)一步的研宄。
[0003] 在Edward Anthony Jenner發(fā)現(xiàn)牛痘疫苗一個(gè)世紀(jì)以后，德國(guó)醫(yī)生Paul Ehrlich (1854-1915)和美國(guó)醫(yī)生 William Bradley Coley (1862-1936)最早提出了腫瘤疫 苗的概念。二十世紀(jì)九十年代中期，治療性疫苗概念的被正式提出，各種研宄和開發(fā)工作也 廣泛開展起來(lái)。腫瘤治療性疫苗目前是治療性疫苗研發(fā)中的"重中之重"。它夠激活機(jī)體免 疫系統(tǒng)，產(chǎn)生特異性抗腫瘤效應(yīng)，一方面有利于清除外科手術(shù)后殘留的腫瘤細(xì)胞，另一方面 能夠產(chǎn)生免疫記憶，防止腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。
[0004] 腫瘤疫苗是一種腫瘤主動(dòng)免疫治療方式，通過接種使得機(jī)體獲得一種內(nèi)源性的抗 腫瘤免疫應(yīng)答反應(yīng)。這種免疫應(yīng)答可以是特異性的，針對(duì)選定的一些特定腫瘤抗原；也可以 是非特異性的，免疫應(yīng)答并不針對(duì)某種特定的抗原，例如全腫瘤細(xì)胞疫苗。腫瘤疫苗主要分 為腫瘤細(xì)胞疫苗、重組蛋白疫苗、肽疫苗和基因疫苗四種類型，基因疫苗根據(jù)載體的不同可 以分為細(xì)菌載體基因疫苗、病毒載體基因疫苗和裸質(zhì)粒DNA疫苗。
[0005] 近年來(lái)腫瘤DNA疫苗的研宄得到了廣泛關(guān)注，逐漸成為腫瘤免疫治療領(lǐng)域的研宄 熱點(diǎn)。大量的研宄發(fā)現(xiàn)，腫瘤DNA疫苗與其它類型腫瘤疫苗相比，具有一定的優(yōu)勢(shì)。第一， DNA疫苗免疫機(jī)體后與病毒感染過程相似，在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄翻譯，表達(dá)抗原蛋白，分 泌到細(xì)胞外，或在細(xì)胞內(nèi)修飾后通過MHC I途徑遞呈至抗原遞呈細(xì)胞（APCs)，進(jìn)一步激活 體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。第二，DNA疫苗更加安全且產(chǎn)生的靶抗原特異性更強(qiáng)。與之相比，病 毒載體基因疫苗則會(huì)引起機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)外源性病毒蛋白的免疫反應(yīng)，從而產(chǎn)生針對(duì)疫苗的 排斥，不能多次應(yīng)用，降低了疫苗的效果。第三，電穿孔技術(shù)的應(yīng)用使DNA疫苗的表達(dá)效率 的得到了極大地提高。電穿孔使細(xì)胞膜在瞬間出現(xiàn)多個(gè)孔道，增加了質(zhì)粒DNA的導(dǎo)入量，使 肌肉或真皮內(nèi)注射的質(zhì)粒DNA能夠更多地被肌肉細(xì)胞、角化細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞 (DCs)攝取。第四，DNA疫苗構(gòu)建更加簡(jiǎn)單，生產(chǎn)和加工過程更加簡(jiǎn)便。
[0006] DNA疫苗成功的關(guān)鍵是如何打破免疫耐受誘發(fā)高效的免疫應(yīng)答，并且同時(shí)避免產(chǎn) 生自身免疫損傷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明針對(duì)惡性腫瘤治療中的核心難題"免疫耐受"，基于復(fù)制子DNA疫苗載體 PSVK，開展了系統(tǒng)性的免疫增效策略研宄，并成功構(gòu)建了一種新型的抗腎癌雙質(zhì)粒可復(fù)制 型DNA疫苗。
[0008] 本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種抗腎癌雙質(zhì)粒可復(fù)制型DNA疫苗。其活性成分包 括以下組分：
[0009] 1)以復(fù)制子DNA疫苗載體pSVK為出發(fā)載體構(gòu)建的攜帶復(fù)合基因 sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7 (簡(jiǎn)稱 G250FGB)的可復(fù)制型 DNA 疫苗載體 pSVK-G250FGB， 所述G250FGB復(fù)合基因是自5'端至3'端依次由tG250復(fù)合抗原基因、人IgG Fc段基 因 （GenBank 號(hào)：Z17370)、GPI 基因 （GenBank 號(hào)：XM676434)、GM/CSF 基因 （GenBank 號(hào)： NM-000758)和B7. 1基因（GenBank號(hào)：NM-005191)組成的融合基因，G250FGB復(fù)合基因的 結(jié)構(gòu)如圖IA所示；
[0010] 2)以復(fù)制子DNA疫苗載體pSVK為出發(fā)載體構(gòu)建的攜帶腫瘤血管復(fù)合基因（CAVE) 的抗腫瘤血管復(fù)制子DNA疫苗pSVK-CAVE，所述腫瘤血管復(fù)合基因（CAVE)自5'端至3'端依 次由小鼠 VEGFR2胞外區(qū)1-4段（腫瘤血管靶抗原）基因（GenBank號(hào)：57923,286-1536bp)、 人 IgG Fe 段基因 （GenBank 號(hào)：Z17370)基因 、GPI 基因 （GenBank 號(hào)：XM676434)、人 IL12A 基因（GenBank號(hào)：24430218)和人IL12B基因（GenBank號(hào)：24497437)構(gòu)成，腫瘤血管復(fù)合 基因的結(jié)構(gòu)如圖IC所示。
[0011] 所述復(fù)制子DNA疫苗載體pSVK的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
[0012] tG250復(fù)合抗原基因是異種化嵌合抗原基因，同時(shí)含有人腎癌抗原G250、猴和鼠 的腎癌抗原CAIX基因，為了打破機(jī)體對(duì)自身抗原的免疫耐受，采用了分區(qū)段異種化抗原 嵌合設(shè)計(jì)，使同源性較高的區(qū)段被異種化抗原代替，從而誘導(dǎo)不同種屬間的交叉免疫反 應(yīng)。具體來(lái)講，tG250抗原基因中自5'端第1-132、169-183、298-513位堿基分別為猴腎 癌抗原 CAIX 基因 （Genebank 號(hào)：XM001088481)，自 5' 端第 133-168、247-258、514-897、 1084-1092 位堿基分別為人 G250 基因 ，（Genebank 號(hào)：A J010158),而自 5' 端第 184-246、 259-297、898-1083、1093-1131位堿基分別為選取的是鼠腎癌抗原CAIX基因（Genebank號(hào)： BC120544)，tG250復(fù)合抗原基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。
[0013] 所述tG250復(fù)合抗原基因與人IgG Fc段和GPI基因融合，然后與GM/CSF基因和 B7. 1基因通過IRES序列相連組成G250FGB復(fù)合基因，其中，自5'端第70-201、238-252、 367-582位堿基分別為猴腎癌抗原CAIX基因，自5'端第202-237、316-327、583-966、 1153-1161 位堿基分別為人 G250 基因，自 5' 端第 253-315、328-366、967-1152、1162-1200 位堿基分別為鼠腎癌抗原CAIX基因，自5'端第1201-2473位堿基為Fc段基因，自5'端 第2474-2600位堿基為GPI基因，自5'端第2622-3246位堿基為IRES序列，自5'端第 3253-3684位堿基為GM/CSF基因，自5'端第3709-4497位堿基為B7. 1基因，所述G250FGB 復(fù)合基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示。
[0014] 將以pSVK為出發(fā)載體構(gòu)建的攜帶復(fù)合基因 sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7(簡(jiǎn)稱 G250FGB)的重組可復(fù)制型腎癌治療性DNA疫苗命名為pSVK-G250FGB，其核苷酸序列如序列 表中序列4所示，其中，自5'端第7415-11913位堿基為G250FGB復(fù)合基因序列。
[0015] 所述腫瘤血管復(fù)合基因（CAVE)由小鼠 VEGFR2胞外區(qū)1-4段基因與人IgG Fc段 和GPI基因融合，然后與人IL12A和IL12B基因通過IRES序列相連組