一種仿軟骨細胞外基質(zhì)可注射水凝膠的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種可注射水凝膠的制備方法，特別是一種仿軟骨細胞外基質(zhì)可注射水凝膠的制備方法，屬于生物醫(yī)用材料制備技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]軟骨是一種無血管、神經(jīng)和淋巴腺的組織，主要由一些稀疏的軟骨細胞包埋在較為密集的細胞外基質(zhì)中組成。這種特殊的組織結(jié)構(gòu)，使得軟骨對于損傷的自修復能力極低，如若治療不恰當，可能會導致嚴重的功能障礙。臨床上，由各種原因引起的軟骨損傷十分常見。
[0003]目前，臨床上常用的用于關(guān)節(jié)軟骨修復的方法主要有微骨折法、自體軟骨移植和同種異體軟骨移植。這些方法雖然在一定程度上降低了軟骨損傷帶給病人的疼痛感，提高了軟骨的部分功能，但是，存在著供體匱乏、機體對植入組織的免疫排斥反應、移植造成的疾病傳播等缺點，難以滿足臨床需要。
[0004]近些年來，將軟骨細胞在合適的基質(zhì)中培養(yǎng)增殖，然后移入軟骨缺損部位，進行修復的方法成為一種理想的解決途徑。這里，基質(zhì)對軟骨的修復效果起著至關(guān)重要的作用。在諸多材料形成的基質(zhì)中，可注射型水凝膠，由于其結(jié)構(gòu)形態(tài)更接近于天然軟骨基質(zhì)，能更好地為受損軟骨組織提供適合其修復與再生的微環(huán)境，同時具有精確填充任意形狀和深度的軟骨損傷部位、緊密粘合周圍組織、微創(chuàng)注入等可注射特性，而成為當前最為理想的軟骨修復材料之一。
[0005]可注射型水凝膠的制備方法很多，包括化學(或輻射)交聯(lián)、相轉(zhuǎn)變、分子自組裝等。然而，這些制備方法由于存在著諸如交聯(lián)劑(或引發(fā)劑)具有一定的毒性、交聯(lián)反應時較大反應熱的釋放、射線對細胞和組織的損傷、原位形成凝膠的時間較長等缺陷，大大限制其在軟骨修復中的普遍應用。
[0006]原位光聚合的方法制備軟骨損傷修復用可注射水凝膠，恰能很好地克服上述諸多缺陷，優(yōu)勢顯著。通常，生成這種水凝膠所用的單體一般由含有兩個或多個帶有光活性基團的水溶性天然高分子或合成高分子單體組成。然而，由單一的合成高分子單體所形成的原位光聚合水凝膠，表面缺乏細胞可以識別的位點，不利于細胞特異性黏附及特異基因的激活；而由單一的天然高分子單體所形成的原位光聚合水凝膠機械強度差，不足以匹配軟骨組織。雖然研宄者們做了改進，構(gòu)建了系列光聚合天然高分子-合成高分子雜化水凝膠支架，然而，這些雜化水凝膠支架，由于微環(huán)境中合成高分子的引入，致使整個支架材料的生物活性顯著降低，與全天然高分子水凝膠支架相比，在促進軟骨細胞的黏附、生長與增殖方面，差距明顯。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種生物相容性好、強度高的仿軟骨細胞外基質(zhì)可注射水凝膠的制備方法。
[0008]為了實現(xiàn)上述目的，其技術(shù)方案如下ο
[0009]一種仿軟骨細胞外基質(zhì)可注射水凝膠的制備方法，所述制備方法按以下步驟進行:
a.馬來?；讱ぐ返闹苽?br> 將甲殼胺和馬來酸酐置于非質(zhì)子溶劑中，甲殼胺與非質(zhì)子溶劑質(zhì)量體積比為1:10?200，甲殼胺分子鏈上氨基與馬來酸酐的酸酐基摩爾比為1:0.1?10，室溫下攪拌均勻，在25?90°C條件下反應，反應時間為12?48小時，反應結(jié)束后，在甲殼胺、馬來酸酐、非質(zhì)子溶劑形成的混合溶液中加入無水丙酮至混合溶液無沉淀析出為止，收集沉淀物，沉淀物在室溫下真空干燥2天，得到摩爾取代度為0.05?0.5的馬來?；讱ぐ贰?br>[0010]b.甲基丙烯?；z素蛋白納米微粒的制備
將甲基丙烯酸羥乙酯、丙烯酰氯、三乙胺分別置于甲苯中，甲基丙烯酸羥乙酯、丙烯酰氯、三乙胺的摩爾比為1:1.1:1.1，甲基丙烯酸羥乙酯與甲苯的體積比為1:10，攪拌均勻，在O?5°C條件下反應4小時，反應結(jié)束后，將甲基丙烯酸羥乙酯、丙烯酰氯、三乙胺、甲苯形成的混合溶液，按去離子水、I mol/L鹽酸、I mol/L氫氧化鈉溶液的順序?qū)谆┧崃u乙酯、丙烯酰氯、三乙胺、甲苯形成的混合溶液進行洗滌，分液得上層亮黃色液體，亮黃色液體在35°C條件下真空干燥24h，得到丙烯酰基氧乙基甲基丙烯酸酯。
[0011]將絲素蛋白納米微粒和上述丙烯酰基氧乙基甲基丙烯酸酯分別置于非質(zhì)子溶劑中，絲素蛋白納米微粒與非質(zhì)子溶劑重量體積比為1:50?200，絲素蛋白納米微粒分子鏈上氨基與丙烯?；跻一谆┧狨ケ；柋葹?:1?20，室溫下攪拌均勻，在25?70°C條件下反應，反應時間為12?24小時，反應結(jié)束后，在絲素蛋白納米微粒、丙烯?；跻一谆┧狨ァ⒎琴|(zhì)子溶劑形成的固液體系中，加入無水丙酮至固液體系中無沉淀析出為止，收集沉淀物，沉淀物在室溫下真空干燥2天，得到摩爾取代度為0.04?0.2的甲基丙烯酰化絲素蛋白納米微粒。
[0012]c.仿軟骨細胞外基質(zhì)可注射水凝膠的制備
將經(jīng)步驟a得到的馬來酰化甲殼胺、經(jīng)步驟b得到的甲基丙烯?；z素蛋白納米微粒、生長因子、光引發(fā)劑、磷酸鹽緩沖溶液按照質(zhì)量百分比分別為:
馬來?；讱ぐ??10%
甲基丙烯?；z素蛋白納米微粒0.1?3%
生長因子O?0.01%
光引發(fā)劑0.05?0.1%
磷酸鹽緩沖溶液86.89?97.85%
的比例，室溫下高速混合均勻，得到粘度為10000?lOOOOOcps的仿軟骨細胞外基質(zhì)前體溶液，仿軟骨細胞外基質(zhì)前體溶液在紫外光下照射I?5 min，形成仿軟骨細胞外基質(zhì)可注射水凝膠，其中，紫外光波長為320-480 nm，光強為5?100 mW/cm2。
[0013]所述非質(zhì)子溶劑為二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺或二甲基亞砜中的一種。
[0014]所述生長因子為轉(zhuǎn)移生長因子β或成纖維生長因子或骨形態(tài)發(fā)生蛋白或胰島素生長因子中的一種。
[0015]所述光引發(fā)劑為2-羥基-2-甲基-1-對羥乙基醚基苯基丙酮或1-羥基環(huán)己基苯基甲酮或2，2- 二甲氧基-苯基乙酮中的一種。
[0016]所述磷酸鹽緩沖溶液為pH為7.0?7.4的Na2HPO4-NaH2POjl沖溶液或K2HP04-KH2P031沖溶液的一種。
[0017]由于采用以上技術(shù)方案，本發(fā)明的仿軟骨細胞外基質(zhì)可注射水凝膠的制備方法，其有益技術(shù)效果是:
(I)本發(fā)明的制備方法采用甲基丙烯酰化絲素蛋白、馬來?；讱ぐ贩謩e模擬結(jié)構(gòu)相似的軟骨細胞外基質(zhì)的主要成分膠原蛋白和糖胺聚糖，從仿生角度以全天然高分子構(gòu)建了可注射水凝膠，全面模擬軟骨細胞外基質(zhì)的微環(huán)境，顯著促進軟骨細胞的黏附、生長與增殖，生物相容性好。
[0018](2)本發(fā)明的制備方法采用紫外光聚合技術(shù)，將甲基丙烯?；z素蛋白微粒作為主交聯(lián)點嵌入到馬來?；讱ぐ纺z中，形成納米微粒共價交聯(lián)甲殼胺分子鏈的納米增強型水凝膠結(jié)構(gòu)，賦予水凝膠高的機械強度，完全克服天然高分子形成的水凝膠強度低的普遍缺陷。本發(fā)明制備方法簡單，成本低，易工業(yè)化生產(chǎn)。
【具體實施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明仿軟骨細胞外基質(zhì)可注射水凝膠的制備方法作進一步詳細描述。
[0020]一種仿軟骨細胞外基質(zhì)可注射水凝膠的制備方法，所述制備方法按以下步驟進行:
a.馬來酰化甲殼胺的制備
將甲殼胺和馬來酸酐置于非質(zhì)子溶劑中，甲殼胺與非質(zhì)子溶劑質(zhì)量體積比為1:10?200，甲殼胺分子鏈上氨基與馬來酸酐的酸酐基摩爾比為1:0.1?10，室溫下攪拌均勻，在25?90°C條件下反應，反