緩釋氯己定無(wú)定形磷酸鈣納米顆粒的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種負(fù)載氯己定的無(wú)定形磷酸鈣納米顆粒及其制備方法，特別涉及一 種可用于保護(hù)牙本質(zhì)I型膠原，促進(jìn)其再礦化的負(fù)載氯己定無(wú)定形磷酸鈣納米顆粒的制備 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 粘接酸蝕牙本質(zhì)或累及牙本質(zhì)的齲壞均存在暴露的膠原纖維被基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMPs)破壞的問(wèn)題，這將導(dǎo)致粘接界面和牙本質(zhì)的破壞。研究者們不斷試圖通過(guò)仿生礦化 手段促進(jìn)暴露的膠原纖維再礦化，使足夠小的羥基磷灰石晶體替換膠原纖維網(wǎng)纖維內(nèi)外的 水分，避免膠原纖維的暴露和酶解。無(wú)定形磷酸鈣是羥基磷灰石形成過(guò)程中的一種無(wú)定形 中間相，存在于牙本質(zhì)形成的初始階段。通過(guò)這一中間相的轉(zhuǎn)變，生物體可以克服經(jīng)典晶體 成核需要的能壘，從而更為高效地合成羥基磷灰石。研究表明，無(wú)定形磷酸鈣及其復(fù)合材料 無(wú)細(xì)胞毒性，生物活性良好、細(xì)胞黏附性高，能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、提高堿性磷酸酶活性并促 進(jìn)骨橋蛋白的合成，目前廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，包括用于骨科材料、組織工程支架、釋 藥載體等。然而膠原纖維再礦化過(guò)程緩慢，礦化過(guò)程中膠原纖維容易被持續(xù)作用的MMPs破 壞，使再礦化過(guò)程缺乏模板而失敗。氯己定是最常被研究的MMPs抑制劑，可以有效防止膠 原纖維降解，只是目前研究大多使用氯己定溶液，無(wú)法長(zhǎng)期有效發(fā)揮作用。
[0003] 為此，本發(fā)明擬將上述兩種問(wèn)題結(jié)合，通過(guò)制備負(fù)載氯己定的無(wú)定形磷酸鈣納米 顆粒，期望實(shí)現(xiàn)氯己定的緩釋，從而實(shí)現(xiàn)牙本質(zhì)再礦化過(guò)程中長(zhǎng)期有效保護(hù)膠原纖維，提高 再礦化的時(shí)效性。所用設(shè)備簡(jiǎn)單，方法易行。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供一種負(fù)載氯己定無(wú)定形磷酸鈣納米顆粒的制備方法，產(chǎn)物尺寸小，外 形為較規(guī)則的球形，長(zhǎng)效釋放氯己定和鈣磷離子，并能隨PH降低加快釋放鈣磷離子的速 度，可能應(yīng)用于口腔直接粘接修復(fù)材料領(lǐng)域。
[0005] 牙本質(zhì)膠原纖維仿生礦化過(guò)程中，膠原纖維易受到MMPs酶的降解，導(dǎo)致膠原纖維 仿生礦化失敗。氯己定可以抑制MMPs酶的活性，從而保護(hù)膠原纖維。本發(fā)明通過(guò)研制負(fù)載 氯己定的無(wú)定形磷酸鈣納米顆粒，提高牙本質(zhì)仿生礦化的時(shí)效性。
[0006] 本發(fā)明的方法特點(diǎn)是可以在仿生礦化過(guò)程中，利用氯己定保護(hù)膠原纖維，使膠原 纖維仿生礦化得以順利進(jìn)行。
[0007] 本發(fā)明的緩釋氯己定無(wú)定形磷酸鈣納米顆粒（也稱無(wú)定形磷酸鈣納米球）。本發(fā) 明以可溶性鈣鹽和可溶性磷酸鹽作為鈣磷源，包覆醋酸氯己定或葡萄糖酸氯己定，以聚丙 烯酸作為穩(wěn)定劑，以非離子表面活性劑囊泡為模板制得所述無(wú)定形磷酸鈣納米顆粒。具體 的，本發(fā)明的方法包括下述步驟：
[0008] 1)制備含氯已定的非離子表面活性劑囊泡懸浮液；
[0009] 2)在攪拌下，在步驟1)制備的非離子表面活性劑囊泡的懸浮液體系中加入可溶 性鈣鹽溶液和磷酸鹽溶液，反應(yīng)得到無(wú)定形磷酸鈣納米顆粒的懸浮液；
[0010] 3)在所述步驟2)得到的磷酸鈣納米顆粒的懸浮液中加入不同濃度穩(wěn)定劑，攪拌 均勻，然后離心得到沉淀，將沉淀洗滌、真空干燥得到無(wú)定形磷酸鈣納米顆粒。
[0011] 本發(fā)明原理首先通過(guò)調(diào)整制備過(guò)程中氯己定溶液的濃度，得到不同載藥量的負(fù)載 氯己定無(wú)定形磷酸鈣納米顆粒，以期實(shí)現(xiàn)氯己定在膠原纖維再礦化過(guò)程中的持續(xù)保護(hù)作 用。其次，超聲形成的納米尺寸非離子表面活性劑囊泡能夠作為模板，輔助磷酸鈣包覆氯己 定，之后去除模板，得到納米顆粒。
[0012] 所述步驟1)中，所述含氯已定的非離子表面活性劑囊泡的懸浮液中，所述氯己定 的質(zhì)量百分濃度為2-20% ;可根據(jù)所需載藥量進(jìn)行調(diào)整。
[0013] 所述步驟1)中，制備非離子表面活性劑囊泡的懸浮液的方法包括制備含有非離 子表面活性劑（如SpanSO或TweenSO)、氯已定（不同濃度的醋酸氯己定或葡萄糖酸氯己 定）和聚乙二醇的溶液，超聲得到納米尺寸非離子表面活性劑囊泡的懸浮液；所述非離子 表面活性劑為SpanSO或TweenSO ;所述氯已定為醋酸氯己定或葡萄糖酸氯己定。所述氯己 定與Span80或Tween80的重量比不限。
[0014] 所述步驟1)中，所述超聲步驟的條件為20-25°C，30-50KHz超聲10-30分鐘；所述 超聲步驟的條件優(yōu)選20-25°C，40KHz超聲30分鐘。所述含有非離子表面活性劑，氯已定和 聚乙二醇的溶液中，非離子表面活性劑的濃度為0. 10-0. 20g/mL，優(yōu)選0. 20g/mL，聚乙二醇 的濃度大于〇. 01g/mL，優(yōu)選0. 01g/mL。所述含有非離子表面活性劑、氯已定和聚乙二醇的 溶液以緩沖溶液為溶劑配制，所述緩沖溶液為Tris-HCl緩沖溶液；所述緩沖溶液優(yōu)選為pH 為 8. 0、0· 5mol/L 的 Tris-HCI 緩沖液。
[0015] 所述步驟2)中，所述鈣鹽溶液和磷酸鹽溶液的添加，鈣、磷元素摩爾比為1~2,優(yōu) 選 1. 3 :1。
[0016] 在本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案中，所述鈣鹽為可溶性鈣鹽，如氯化鈣、碳酸氫鈣；所述 磷酸鹽為可溶性磷酸鹽優(yōu)選為磷酸氫二鈉。所述鈣鹽溶液的濃度為0. 〇5mol/L以上，優(yōu)選 為0· 13mol/L ;所述磷酸鹽溶液的濃度為0· 05mol/L以上，優(yōu)選為0· lmol/L。
[0017] 所述步驟2)中，所述反應(yīng)的溫度為20-25°C，所述洗滌劑為乙醇、三氯甲烷，優(yōu)選 乙醇。
[0018] 所述步驟3)中，所述穩(wěn)定劑為聚丙烯酸、Mg2+，優(yōu)選聚丙烯酸。
[0019] 所述步驟3)中，所述穩(wěn)定劑的添加量為濃度大于500 μ g/mL，優(yōu)選500 μ g/mL。
[0020] 所述步驟3)中，離心速率為500-3000轉(zhuǎn)/分，優(yōu)選3000轉(zhuǎn)/分，離心時(shí)間為1-5 分鐘，優(yōu)選5分鐘。
[0021] 本發(fā)明具有以下積極意義：
[0022] 1.本發(fā)明首次利用納米技術(shù)利用無(wú)定形磷酸鈣包載氯己定，可以使膠原纖維再礦 化過(guò)程中得到保護(hù)，提高牙本質(zhì)膠原纖維再礦化的效率。利用模板法制備出尺寸可控、外形 規(guī)則的納米球。調(diào)整穩(wěn)定劑的類型和濃度，提高固體狀態(tài)下無(wú)定形磷酸鈣的穩(wěn)定性，便于應(yīng) 用于口腔直接粘接修復(fù)材料中。
[0023] 2.本發(fā)明通過(guò)調(diào)整氯己定濃度，得到一系列不同載藥量的納米球。
[0024] 3.本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單易行，適合大規(guī)模制備生產(chǎn)，制備工藝簡(jiǎn)單。
[0025] 4.本發(fā)明制備方法制備的納米球外觀形態(tài)完整均勻，呈典型球形，粒徑約為 20-100nm，尺寸可控具有較好流動(dòng)性，便于進(jìn)入膠原纖維網(wǎng)內(nèi)外。
[0026] 本發(fā)明屬于國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（51103001)和北京市科委基金 (Z141100000514016)中的一部分，所獲得的結(jié)果將應(yīng)用于口腔創(chuàng)新品種臨床前研究特別是 新型口腔修復(fù)材料的生產(chǎn)及臨床應(yīng)用。
【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖1表示實(shí)施例1中制備的負(fù)載氯己定無(wú)定形磷酸鈣納米球掃描電鏡下形貌
[0028] 圖2表示實(shí)施例1中負(fù)載氯己定無(wú)定形磷酸鈣制備200h后傅里葉紅外光譜分析
[0029] 圖3表示實(shí)施例2負(fù)載氯己定無(wú)定形磷酸鈣制備200h后X線衍射分析
[0030] 圖4表示實(shí)施例3負(fù)載氯己定無(wú)定形磷酸鈣制備200h后X線衍射分析
[0031] 圖5表示實(shí)施例3負(fù)載氯己定無(wú)定形磷酸鈣制備200h后透射電鏡下形貌
【具體實(shí)施方式】
[0032] 根據(jù)本發(fā)明，提供一種緩釋氯已定的無(wú)定形磷酸鈣納米球的制備方法，具體的，本 發(fā)明的方法包括下述步驟：
[0033] 1)制備含氯已定的非離子表面活性劑囊泡的懸浮液；
[0034] 2)在攪拌下，在步驟1)制備的非離子表面活性劑囊泡的懸浮液體系中加入鈣鹽 溶液和磷酸鹽溶液，反應(yīng)得到無(wú)定形磷酸鈣納米顆粒的懸浮液；
[0035] 3)在所述步驟2)得到的磷酸鈣納米顆粒的懸浮液中加入穩(wěn)定劑，攪拌均勻，然后 離心得到沉淀，將沉淀洗滌、干燥得到無(wú)定形磷酸鈣納米顆粒。
[0036] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：將非離子表面活性劑和聚乙二醇在氯己定水溶液中 以一定比例混合，超聲得到穩(wěn)定的納米尺寸囊泡。按一定范圍的鈣磷比加入可溶性鈣鹽和 可溶性磷酸鹽，此時(shí)磷酸鈣以囊泡為模板形成納米顆粒。使用聚丙烯酸（PAA)作為穩(wěn)定劑， 可使無(wú)定形磷酸鈣較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)不向羥基磷灰石晶體轉(zhuǎn)化。最