使用免疫刺激性寡核苷酸進(jìn)行長(zhǎng)期的疾病修飾的制作方法
【專利說(shuō)明】使用免疫刺激性寡核苷酸進(jìn)行長(zhǎng)期的疾病修飾
[0001] 本申請(qǐng)為2007年11月9日提交的、發(fā)明名稱為"使用免疫刺激性寡核苷酸進(jìn)行長(zhǎng) 期的疾病修飾"的PCT申請(qǐng)PCT/US2007/084358的分案申請(qǐng)，所述PCT申請(qǐng)進(jìn)入中國(guó)國(guó)家階 段的日期為2009年7月9日，申請(qǐng)?zhí)枮?00780049562. 3。
[0002] 相關(guān)申請(qǐng)
[0003] 本申請(qǐng)要求在2006年11月9日提交的臨時(shí)專利申請(qǐng)60/865, 089的優(yōu)先權(quán)，該公 開(kāi)以其整體通過(guò)參考被并入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明涉及通過(guò)使用一個(gè)或多個(gè)免疫刺激性序列（"ISS"）的多次施用來(lái)治療哮 喘的方法，所述施用賦予長(zhǎng)期的疾病修飾。
[0005] 發(fā)明背景
[0006] 由感染或其它抗原攻擊導(dǎo)致的免疫應(yīng)答類型通常能夠通過(guò)在該應(yīng)答中涉及的T 輔助（Th)細(xì)胞的亞型而區(qū)分。Thl亞型負(fù)責(zé)經(jīng)典的細(xì)胞介導(dǎo)的功能，例如遲發(fā)型的超敏反 應(yīng)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL)的激活，而Th2亞型更有效地作為B-細(xì)胞激活的輔助細(xì)胞 發(fā)揮功能。對(duì)抗原的免疫應(yīng)答類型通常受到應(yīng)答抗原的細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子的影響。據(jù)認(rèn) 為，Th 1和Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的區(qū)別反映了這兩個(gè)亞型的不同的生物功能。見(jiàn)，例如， Romagnani(2000)Ann. Allergy Asthma Immunol.，85:9-18。
[0007] Thl亞型可能特別適于應(yīng)答病毒感染、細(xì)胞內(nèi)病原體、和腫瘤細(xì)胞，因?yàn)槠浞置诩?活CTL的IL-2和IFN-γ。Th2亞型可能更適合應(yīng)答自由生活的細(xì)菌和蠕蟲(chóng)類寄生蟲(chóng)和可能 介導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)，因?yàn)橐阎狪L-4和IL-5分別誘導(dǎo)IgE產(chǎn)生和嗜酸性粒細(xì)胞激活。通常，Thl 和Th2細(xì)胞分泌不同模式的細(xì)胞因子，并由此一種類型的應(yīng)答能夠調(diào)節(jié)另一類型應(yīng)答的活 性。Thl/Th2平衡的移動(dòng)能夠?qū)е吕邕^(guò)敏反應(yīng)，或?qū)е略黾拥腃TL應(yīng)答。
[0008] -段時(shí)間以來(lái)，已經(jīng)認(rèn)識(shí)到Thl-型免疫應(yīng)答能夠在哺乳動(dòng)物中通過(guò)施用某些ISS 而被誘導(dǎo)。ISS包括稱為免疫刺激性序列（"ISS"）的序列，該ISS通常包括CG。見(jiàn)，例 如，PCT 公開(kāi)TO 98/55495、TO 97/28259、美國(guó)專利 6, 194,388 ;6, 207, 646 和 6, 498, 148 ;和 Krieg等人（1995)Nature、374:546-49。對(duì)于許多感染性疾病，例如肺結(jié)核和瘧疾，Th2-型 應(yīng)答幾乎沒(méi)有抗感染價(jià)值?；诘鞍踪|(zhì)的疫苗通常誘導(dǎo)Th2-型免疫應(yīng)答，表征為高滴度的 中和抗體而沒(méi)有顯著的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。而且，在某些適應(yīng)癥中一些類型的抗體應(yīng)答是不 適合的，最顯著的是在變態(tài)反應(yīng)中，其中IgE抗體應(yīng)答能導(dǎo)致過(guò)敏性休克。
[0009] 在脊椎動(dòng)物中，粒細(xì)胞（嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞） 與內(nèi)皮細(xì)胞粘附之后釋放炎性介質(zhì)，例如白三烯類、主要堿性蛋白和組胺。在易感個(gè)體中， 導(dǎo)致的炎癥能夠損壞受影響的各組織。
[0010] 最常見(jiàn)的病理學(xué)炎癥是哮喘，其表征為顯著的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)呼吸道，繼之為 炎性誘導(dǎo)的組織損壞。這類病癥的常規(guī)治療通常涉及抑制在粒細(xì)胞粘著于內(nèi)皮之后釋放的 炎癥介質(zhì)的活性（例如，通過(guò)遞送腎上腺皮質(zhì)激素組合物于受影響的組織）。在已知誘導(dǎo)炎 癥的抗原的身份時(shí)，可以通過(guò)免疫方法提供抵抗進(jìn)一步抗原攻擊的一定免疫保護(hù)。然而，盡 管有效刺激中和抗體的產(chǎn)生，但規(guī)范的免疫法不能有效刺激較長(zhǎng)期的細(xì)胞免疫。而且，抗原 免疫可以刺激IL-4和IL-5的產(chǎn)生。IL-5促進(jìn)粒細(xì)胞粘附于內(nèi)皮，而IL-4誘導(dǎo)免疫球蛋白 轉(zhuǎn)化為IgE同種型，存在過(guò)敏反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。
[0011] 關(guān)于過(guò)敏性哮喘，已知證實(shí)用ISS預(yù)治療可以在過(guò)敏性哮喘的小鼠模型中 抑制變應(yīng)原誘導(dǎo)的氣道嗜酸性粒細(xì)胞增多和氣道高反應(yīng)性。Broide等人（1998) J. Immunol. 161:7054。也已證實(shí)，該抑制還與氣道內(nèi)ISS-誘導(dǎo)的Th2-型細(xì)胞因子水平的 下調(diào)有關(guān)。Hessel等人、（2005) J. Exp. Med.、202 (11): 1563。然而，因?yàn)槭窃谧儜?yīng)原攻擊之 前不久給出ISS治療，故這些效應(yīng)集中于ISS治療的直接效應(yīng)。然而，用ISS長(zhǎng)期治療的效 果大部分仍是未知的。此外，能賦予長(zhǎng)期益處的哮喘治療法也尚未被充分表征。這里公開(kāi) 的本發(fā)明為解決上述問(wèn)題提供了有用的教導(dǎo)。
[0012] 這里引用的全部專利、專利申請(qǐng)和出版物將此以其整體通過(guò)參考被并入。
[0013] 發(fā)明概述
[0014] 本發(fā)明提供通過(guò)向個(gè)體給予有效量的ISS的多次施用在有需要的個(gè)體中治療哮 喘的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用該ISS至少3次。在另一實(shí)施方案中，以每周為基礎(chǔ)進(jìn) 行該多次施用。在另一實(shí)施方案中，該方法導(dǎo)致對(duì)哮喘的長(zhǎng)期疾病修飾。在另一實(shí)施方案 中，該長(zhǎng)期疾病修飾是在個(gè)體中Th2應(yīng)答的減少。在另一實(shí)施方案中，在個(gè)體中Th2應(yīng)答的 減少是選自IL-4、IL-5、IL-10和IL-13的任一細(xì)胞因子的減少。在另一實(shí)施方案中，該長(zhǎng) 期疾病修飾在最后施用ISS之后持續(xù)至少13周。在另一實(shí)施方案中，該方法導(dǎo)致對(duì)哮喘 的長(zhǎng)期疾病修飾，其中該哮喘是過(guò)敏性哮喘。在另一實(shí)施方案中，該ISS選自由1018 ISS、 含有CpG的ISS、和嵌合性免疫調(diào)節(jié)性化合物組成的組。在另一實(shí)施方案中，該ISS是1018 ISS。在另一實(shí)施方案中，在外來(lái)變應(yīng)原（adventitious allergen)存在下施用ISS。在另 一實(shí)施方案中，外來(lái)變應(yīng)原是豚草。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1描繪當(dāng)用豚草鼻內(nèi)攻擊致敏的小鼠時(shí)對(duì)Th2_型氣道炎性反應(yīng)的發(fā)展重要的 六種基因 ISS的結(jié)果。該數(shù)據(jù)表示為基因/泛素比。
[0016] 圖2描述用1018 ISS預(yù)處理可以抑制對(duì)G0B-5和C2的Th2基因誘導(dǎo)。該數(shù)據(jù)表 示為基因/泛素比。
[0017] 圖3描述在BAL液體中檢測(cè)到的Th2-型細(xì)胞因子IL-4和IL-13水平。雙星號(hào)表 示P〈〇. 01的統(tǒng)計(jì)顯著性。單星號(hào)表示P〈〇. 05的統(tǒng)計(jì)顯著性。
[0018] 圖4描述在BAL液體中檢測(cè)到的Th2-型細(xì)胞因子IL-10和Th 1型細(xì)胞因子INF- γ 的水平。雙星號(hào)表示Ρ〈〇. 01的統(tǒng)計(jì)顯著性。
[0019] 圖5描述在BAL液體中檢測(cè)到的嗜酸性粒細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)。雙星號(hào)表示p〈0. 01的 統(tǒng)計(jì)顯著性。
[0020] 圖6描述在小鼠灌洗液（BAL液體）中測(cè)量的Th2-型細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-10 和IL-13的水平，該小鼠已經(jīng)接受過(guò)多次1018 ISS施用的處理。
[0021] 圖7描述在小鼠灌洗液（BAL液體）中測(cè)量的Th2-型細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-10 和IL-13的水平，該小鼠已經(jīng)經(jīng)過(guò)多次施用1018 ISS或T0LAMBA的處理。
[0022] 圖8描述在豚草誘導(dǎo)的過(guò)敏性哮喘小鼠模型中用1018 ISS長(zhǎng)期鼻內(nèi)處理的效果。
[0023] 發(fā)明詳述
[0024] 這里，本發(fā)明提供經(jīng)過(guò)多次向個(gè)體施予有效量的免疫刺激性序列（ISS)來(lái)治療個(gè) 體中哮喘的方法。在本發(fā)明的一個(gè)方面，可以通過(guò)使用ISS的多次施用，導(dǎo)致長(zhǎng)期的疾病修 飾。長(zhǎng)期的疾病修飾包括在個(gè)體中遏制（suppression) Th2應(yīng)答。在一些情況中，該遏制是 對(duì)Th2應(yīng)答的抑制。
[0025] -般方法
[0026] 除非另外指出，否則本發(fā)明的實(shí)施將使用分子生物（包括重組技術(shù)）、微生物學(xué)、 細(xì)胞生物學(xué)、生化、核酸化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。在 文獻(xiàn)，例如 Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第二版（Sambrook 等人、1989)和 Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第三版（Sambrook 和 Russel、2001)、（這里 其聯(lián)合和分別地被稱為"Sambrook"）；01igonucleotide Synthesis (M.J. Gait,編輯、 1984) ；Animal Cell Culture(R. I. Freshney、編輯、1987) ；Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir&C. C. Blackwell、編輯）；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M.Miller&M.P.Calos、編輯、1987) ;Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel 等人編輯、1987、包括至 2001 的增補(bǔ)）；PCR: The Polymerase Chain Reaction、（Mullis 等人編輯、1994) ；Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan 等人編輯、1991) ;The Immunoassay Handbook(D. Wild，編輯、Stockton Press NY、1994); Bioconjugate Techniques (Greg T. Hermanson、編輯、Academic Press、1996) ；Methods of Immunological Analysis (R. Masseyeff、W. H. Albert、和 N. A. Staines、編輯、Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH、1993)、Harlow and Lane(1988)Antibodies、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Publications、New York、 和 Harlow and Lane (1999) Using Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press、 Cold Spring Harbor、NY (其聯(lián)合和分別地被稱為"Harlow and Lane"）、Beaucage等人編輯、 Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry(John Wiley&Sons、 Inc. 、 New York、 2000);和Agrawal,編輯、Protocols for Oligonucleotides and Analogs、Synthesis and Properties (Humana Press Inc·、New Jersey、1993)中已經(jīng)充分說(shuō)明 了這類技術(shù)。
[0027] 定義
[0028] 如這里使用的，術(shù)語(yǔ)"變應(yīng)原"意指當(dāng)暴露于受試者時(shí)引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的抗原或分子 的抗原部分，通常為蛋白質(zhì)。通常，受試者例如通過(guò)風(fēng)團(tuán)紅斑測(cè)試或本領(lǐng)域任何已知的方法 所指示的對(duì)變應(yīng)原過(guò)敏。當(dāng)受試者暴露于分子時(shí)即使只有其中一小群受試者呈現(xiàn)變應(yīng)性免 疫應(yīng)答（例如，IgE)，該分子也被稱為變應(yīng)原。由季節(jié)決定，變應(yīng)原可以在環(huán)境中小量或較 大量存在。變應(yīng)原的實(shí)例在以下表1中列出。
[0029] "個(gè)體"是脊椎動(dòng)物，例如小鼠，和優(yōu)選是哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選是人。哺乳動(dòng)物包括，但 不限于，人、靈長(zhǎng)類、農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物、競(jìng)技動(dòng)物、嚙齒類和寵物。
[0030] 物質(zhì)的"有效量"是足以獲得有益效果或期望結(jié)果，包括臨床結(jié)果的量，就此而言， "有效量"由應(yīng)用其的上下文而決定。在施用調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的組合物的情況下，在有或無(wú)共 施用的抗原時(shí)，ISS (和抗原，如果適用的話）的有效量是與單獨(dú)施用該抗原時(shí)獲得的免疫 應(yīng)答相比足以實(shí)現(xiàn)該調(diào)節(jié)作用的量。有效量可以賦予長(zhǎng)期疾病修飾益處，例如遏制和/或 抑制Th2免疫應(yīng)答?？梢栽谝淮位蚨啻问┯弥惺┯糜行Я?。
[0031] 如這里使用和在本技術(shù)領(lǐng)域眾所周知的，"治療"是獲得有益或期望效果，包括臨 床結(jié)果的方法。對(duì)本發(fā)明的目的而言，有益或期望的臨床結(jié)果包括，但不限于，減緩或改善 一個(gè)或多個(gè)癥狀、減輕疾病程度、穩(wěn)定（即，不惡化）疾病狀態(tài)、延遲或減緩疾病進(jìn)展、和/ 或改善或減輕疾病狀態(tài)。"治療"也可以指與如果不接受治療所預(yù)期的存活相比延長(zhǎng)的存 活。
[0032]