噬菌體的p3融合蛋白作為淀粉樣蛋白結(jié)合劑的用圖
【專利說(shuō)明】噬菌體的P3融合蛋白作為淀粉樣蛋白結(jié)合劑的用途
[0001] 本發(fā)明涉及包含絲狀噬菌體g3p蛋白的淀粉樣蛋白結(jié)合片段或此類淀粉樣蛋白 結(jié)合片段的突變體或變體形式的融合蛋白。本發(fā)明包括編碼此類融合蛋白的核酸分子與構(gòu) 建體、以此類核酸分子轉(zhuǎn)化的細(xì)胞以及以重組方式制備此類融合蛋白的方法。此外，本發(fā)明 涉及包含本文所公開的融合蛋白的藥物組合物，以及此類組合物治療性地和預(yù)防性地用于 減少與疾病相關(guān)聯(lián)的淀粉樣蛋白負(fù)荷的用途，所述疾病例如全身性與周邊性淀粉樣蛋白疾 病、神經(jīng)退化性疾病包括神經(jīng)退化性τ病變（tauopathy)和傳染性海綿狀腦炎變（朊病毒 相關(guān)的疾病）。本發(fā)明還包括使用此類組合物來(lái)預(yù)防這些疾病相關(guān)聯(lián)的淀粉樣蛋白累積，以 及使用此類組合物作為診斷劑來(lái)檢測(cè)淀粉樣蛋白，從而診斷此類疾病。
[0002] 絲狀噬菌體M13和相關(guān)絲狀噬菌體已在蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊疾病的動(dòng)物模型中顯 示效用，且因此可代表蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊疾病的潛在治療劑類型。參見美國(guó)專利公開US 2011/0142803,其以引用方式整體并入本文。具體來(lái)說(shuō)，已發(fā)現(xiàn)絲狀噬菌體具有介導(dǎo)清除大 腦中已形成的淀粉樣蛋白的能力。參見例如W02006083795與W02010060073,所述申請(qǐng)以引 用方式整體并入本文。
[0003] M13噬菌體為Ff噬菌體家族成員之一，其具有406個(gè)氨基酸的成熟型g3p AenBank Ref Seq NP_510891. 1提供了參考序列，其包含18個(gè)殘基的氨基端信號(hào)序列。相較于公開 的序列具有氨基酸差異的變體很常見。I家族的絲狀噬菌體的g3p異于Ff家族成員，但即 便如此，g3p在各家族之間仍為高度保守。Stassen等，J Mol Evol (1992) 34:141-52。
[0004] 已獲得 g3p 的晶體結(jié)構(gòu)。Lubkowski 等，Structure (1998) 7 (6) 711-722。所述蛋 白質(zhì)包含3個(gè)折疊結(jié)構(gòu)域，被柔性富含甘氨酸的接頭序列分隔開。存在兩個(gè)氨基端結(jié)構(gòu)域 Nl與N2,其含有262個(gè)氨基酸并相互作用以形成N1-N2復(fù)合物。羧基端（CT，也稱為N3)結(jié) 構(gòu)域含有146個(gè)氨基酸且其通過與g8p進(jìn)行疏水性相互作用使g3p錨泊于噬菌體顆粒中的 g3p〇 Marvin, Current Opin. in Structural Biology (1998)8:150-158。使用 Holliger，J Mol. Biol. (1999)288(4) :649-57中N1-N2結(jié)構(gòu)域融合蛋白2g3p制得的公開可用的帶狀結(jié) 構(gòu)顯示于圖1中。
[0005] 不同于多數(shù)蛋白質(zhì)，未折疊的Nl與N2結(jié)構(gòu)域的潛伏性"閉鎖"形式為g3p產(chǎn)生其 天然生物活性所必需。Eckert和SchmicU. Mol. Biol. (2007)373:452-461。在感染的初期 步驟中，N2經(jīng)由其外緣的殘基結(jié)合于細(xì)菌F纖毛。Deng和Perham, 2002。此種N2的初期 結(jié)合經(jīng)由"打開"N1-N2復(fù)合物而"開啟" g3p，使Nl隨后結(jié)合于共同受體TolA。在g3p的 N1-N2片段中，初步開啟步驟的熱轉(zhuǎn)變使N2于48. 1°C的熔融溫度（Tm)下發(fā)生未折疊。此過 程的一部分涉及Gln212-Pro213肽鍵的異構(gòu)化作用。Pro213在開啟狀態(tài)下轉(zhuǎn)化為反式。Nl 仍維持穩(wěn)定折疊直到第二個(gè)步驟，其發(fā)生于Tm值60. 2°C。綜述于Eckert和Schmid, 2007 中。
[0006] N1-N2片段的突變已被用于研宄多種突變體的穩(wěn)定性與感染力。Eckert和 Schmid，2007。一種被命名為"3A"的變體會(huì)破壞纖毛結(jié)合并降低N2結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性。在此 突變中，Tm值降至42. 6°C。3A攜帶下列突變：W181A、F190A以及F194A。N2中另一突變體 G153D會(huì)使N2不穩(wěn)定，使Tm值降至44. 4°C。突變體Q129H會(huì)穩(wěn)定N2,使T M值升至51. 4°C。 Π 變體于鉸鏈區(qū)含有突變TlOlI與D209Y并增加 N1-N2片段的穩(wěn)定性（Tm= 56. 5°C )。 IHY 含有突變 T101I、Q129H 和 D209Y(TM= 60. 1°C )。IIHY 含有突變 T13I、T101I、Q129H 和 D209Y(TM= 61. 8°C )。突變Q129Y與T13I兩者皆具有穩(wěn)定性，而加入這些突變會(huì)進(jìn)一步增 加熔融溫度（Tm)。噬菌體感染力的變化與g3p內(nèi)結(jié)構(gòu)域相互作用的強(qiáng)度成反比。Eckert和 Schmid, 2007。刪除N2結(jié)構(gòu)域（噬菌體fd ( Δ N2))因解除N2結(jié)構(gòu)域?qū)l與TolA之間結(jié) 合的阻斷效應(yīng)而增加感染力。請(qǐng)參照同上。
[0007] 近來(lái)，g3p還介導(dǎo)絲狀噬菌體與淀粉樣蛋白的結(jié)合，其作用方式類似于噬菌體感染 細(xì)菌的過程。WO 2013/082114公開了噬菌體g3p可直接結(jié)合于淀粉樣蛋白纖維，而所述噬 菌體介導(dǎo)的去凝集取決于此初始結(jié)合步驟。認(rèn)識(shí)到g3p負(fù)責(zé)絲狀噬菌體介導(dǎo)的淀粉樣蛋白 的結(jié)合，這為新類型的治療劑與診斷劑提供了基礎(chǔ)。本發(fā)明提供此類治療與診斷組合物，以 及使用其檢測(cè)、診斷、治療、預(yù)防或延遲淀粉樣蛋白凝集相關(guān)聯(lián)的疾病與病癥的發(fā)生。
[0008] 本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點(diǎn)是部分于下面的說(shuō)明中列出，且自說(shuō)明顯而易見，或可 通過本發(fā)明的實(shí)踐而習(xí)得。本發(fā)明的目的和優(yōu)點(diǎn)將借助在所附權(quán)利要求書中特別指出的要 素和組合來(lái)實(shí)現(xiàn)和達(dá)到。應(yīng)理解，以上概述和以下詳述都僅是示例性和解釋性的，并且不限 制要求保護(hù)的本發(fā)明。
[0009] 附圖簡(jiǎn)述
[0010] 圖1顯示g3p的Nl與N2結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)的帶狀結(jié)構(gòu)。
[0011] 圖2A-2C顯示不同來(lái)源的g3p的比對(duì)。圖2A為噬菌體M13(SEQ ID N0:l)、fd(SEQ ID N0:2)和fl(SEQ ID N0:3)的g3p的比對(duì)，包括共同序列（SEQ ID N0:4)在內(nèi)。圖2B顯 示噬菌體12-2 (SEQ ID NO: 5)和Ike (SEQ ID NO:6)的g3p的比對(duì)，以及12-2與Ike之間 的共同序列（SEQ ID N0:7)。圖2C顯示噬菌體If的g3p氨基酸序列（SEQ ID N0:8)。
[0012] 圖3A和3B顯示噬菌體結(jié)合作用的表面等離子共振（SPR)研宄。利用IO14個(gè)噬菌 體/mL流經(jīng)生物傳感器芯片來(lái)進(jìn)行結(jié)合于A β原纖維與結(jié)合于A β單體的比較。圖3B顯 示從圖3Α中所示的SPR數(shù)據(jù)計(jì)算出的Ka、Kd和K D。
[0013] 圖4A和4B顯示結(jié)合作用的研宄。圖4A顯示隨著fA0 42摩爾量的增加，兩個(gè)噬 菌體劑量（1011個(gè)/mL和10 12個(gè)/mL)的直接結(jié)合測(cè)定。圖4B是結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)研宄，并提供了測(cè) 定M13結(jié)合的Kd值的備選方式。其使用構(gòu)建體1。
[0014] 圖5顯示在淀粉樣蛋白纖維結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定中使用熱變性（方形；于90°C下10分 鐘）與天然構(gòu)象（圓形）的M13(構(gòu)建體1)的結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)作用的結(jié)果。
[0015] 圖6顯示使用在存在或不存在2個(gè)濃度的M13噬菌體（構(gòu)建體1)時(shí)孵育的fAf3 42 的硫代黃素 T(ThT)熒光測(cè)定。
[0016] 圖7A和7B顯示于ThT去凝集測(cè)定中改變個(gè)別測(cè)定參數(shù)的影響。圖7A顯示于兩 個(gè)鹽濃度（0. 15M與I. 5M)存在下的去凝集百分比。圖7B顯示于兩個(gè)溫度（4°C與37°C ) 下fAf3的剩余百分比。其使用構(gòu)建體1。
[0017] 圖8A和8B顯示使用fA|3 42的M13淀粉樣蛋白結(jié)合測(cè)定。在圖8A中，使用18°C 至58°C的孵育溫度達(dá)3小時(shí)以報(bào)告M13結(jié)合作用。圖8B顯示在37°C與50°C下孵育的結(jié)合 動(dòng)力學(xué)。
[0018] 圖9A-9C顯示以蛋白水解方式移除g3p對(duì)噬菌體-淀粉樣蛋白相互作用的影響。 利用蛋白酶Arg C自Ml3噬菌體剪去g3p (Ml3 Λ g3p)。圖9A顯示使用Ml3 Λ g3p噬菌體相 較于天然（其處理方式與經(jīng)Arg C處理的噬菌體相同，但未進(jìn)行蛋白酶處理）噬菌體的Αβ 結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)研宄的結(jié)果。圖9Β顯示相較于天然·菌體，Arg C處理對(duì)于Μ13 Δ g3p 菌體感 染力的影響。圖9C在去凝集測(cè)定中比較Arg C處理的噬菌體與天然噬菌體。
[0019] 圖IOA和IOB顯示使用g3p的N1-N2片段（此處稱為重組可溶性 NlN2(rs-g3p(NlN2)構(gòu)建體 3"））、M13Ag3p (經(jīng) Arg C 處理）和 M13 作為經(jīng)標(biāo)記的 M13 的競(jìng)爭(zhēng)劑結(jié)合至fAf3 42的結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定結(jié)果。圖IOB顯示競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定的重復(fù)結(jié)果。
[0020] 圖11顯示噬菌體fd、IIHY、AAA和M13的競(jìng)爭(zhēng)作用數(shù)據(jù)。噬菌體fd、AAA和IIHY 在50°C下經(jīng)預(yù)活化1. 5小時(shí)，隨后在37°C下孵育45分鐘期間比較了經(jīng)活化與未經(jīng)活化的 FcU AAA與IIHY競(jìng)爭(zhēng)經(jīng)標(biāo)記的M13結(jié)合A β的能力。
[0021] 圖12Α顯示rs-g3p(NlN2)(構(gòu)建體3)的示意圖。圖12Β顯示rs-g3p(NlN2)的離 子交換譜圖。圖12C顯示使用Sephacryl S-300和rs-g3p(NlN2)的凝膠過濾測(cè)定的結(jié)果。 圖12D顯示rs-g3p (N1N2)以及g3p和g8p對(duì)照的蛋白質(zhì)印跡。使M13噬菌體在泳道1和2 中運(yùn)行作為陽(yáng)性對(duì)照，并以多克隆抗-M13抗體檢測(cè)，其可檢測(cè)g8p和g3p。經(jīng)純化的rs-g3p 在泳道3和4中運(yùn)行，并以相同的多克隆抗-M13抗體檢測(cè)。
[0022] 圖13顯示使用rs-g3p (N1N2)(構(gòu)建體3)的SPR數(shù)據(jù)。rs-g3p (N1N2)可有效結(jié)合 fA β 42, Kd為約160nM，但不與單體結(jié)合。
[0023] 圖14顯示用于測(cè)量指定樣本中存在的淀粉樣蛋白的ThT熒光測(cè)定。在存在或不 存在5種濃度的rs-g3p(NlN2)(構(gòu)建體3)時(shí)，將ΙΟμΜ Αβ42單體在37°C下孵育3天。，通 過將結(jié)合后的ThT熒光量化來(lái)測(cè)量在3天結(jié)束時(shí)所形成的纖維量。IC5tl為約20nM，這表明 rs-g3p(NlN2)可有效抑制Αβ42纖維的形成。本圖還表明，結(jié)合作用具有劑量依賴性。重 復(fù)的實(shí)驗(yàn)顯示，IC5tl介于20ηΜ與IOOnM之間。
[0024] 圖15Α顯示在存在或不存在rs-g3p(NlN2)(構(gòu)建體3)時(shí)孵育fA0 42的透射電子 顯微照相（TEM)結(jié)果。圖15B顯示使用于37°C下孵育7天的Αβ 42和2 μΜ rs-g3p(NlN2) (構(gòu)建體3)的ThT熒光測(cè)定結(jié)果。rs-g3p(NlN2)阻斷fAf3 42的形成。
[0025] 圖16證實(shí)rs_g3p (N1N2)(構(gòu)建體3)可有效抑制α -突觸核蛋白纖維的形成。通 過在37°C下以300rpm攪拌4天以使25μΜ的α-突觸核蛋白聚集（參見，條柱1)。圖上 的條柱2代表于37°C下振蕩3天的α -突觸核蛋白單體加上lx KT13的五聚Μ13噬菌體。 條柱2中所示的結(jié)果表明，五聚Μ13可阻斷α-突觸核蛋白纖維聚集。圖上的條柱3代表 α -突觸核蛋白單體+83nMrsg3p單體。條柱3中所示的結(jié)果表明，在抑制α -突觸核蛋白纖 維形成方面，單體的功效較五聚Μ13差。條柱4為陰性對(duì)照，其顯示時(shí)間點(diǎn)為零時(shí)的α-突 觸核蛋白單體。在條