多藥物可控負(fù)載梯度再生骨支架的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制造領(lǐng)域，具體涉及一種用于修復(fù)骨軟骨缺損的人工梯度再生骨 支架的制備方法，特別涉及一種多藥物可控負(fù)載梯度再生骨支架的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 由創(chuàng)傷、感染、骨病、骨腫瘤切除等造成的骨缺損一直是困擾人類的一大難題，因 此也是研宄領(lǐng)域的研宄熱點(diǎn)。臨床上修復(fù)骨缺損的方法有骨移植、人工骨、骨組織工程等方 法，其中骨移植已被臨床證明是修復(fù)各類骨缺損的最佳方法，但是骨移植會(huì)導(dǎo)致手術(shù)創(chuàng)傷， 消耗大量手術(shù)時(shí)間，且往往局限于有限的骨源，以及受限額移植骨形態(tài)、大小等。因此，研宄 組織工程再生骨支架替代人工植骨，以克服自體或異體骨固有的缺點(diǎn)，是臨床迫切需要解 決的問題。
[0003] 從介入治療技術(shù)觀點(diǎn)來看，理想再生骨支架應(yīng)該具有以下特點(diǎn)：（1)良好的生物 相容性，即能夠使材料在成分及結(jié)構(gòu)上與天然骨更為接近；（2)良好的機(jī)械性能，即具有足 夠的支撐力和延展性；（3)良好的骨傳導(dǎo)性，即具有較好的三維微納尺度孔結(jié)構(gòu)，尤其是它 的合適孔徑和孔隙間的連通，為成骨細(xì)胞的生長提供支撐粘附，為細(xì)胞擴(kuò)散和營養(yǎng)物質(zhì)以 及新陳代謝提供通道；(4)具有骨誘導(dǎo)活性，即能夠定向誘導(dǎo)種子細(xì)胞分化成骨細(xì)胞、軟骨 細(xì)胞等；（5)能夠在體內(nèi)降解消失，在體內(nèi)降解速度能夠與新生骨生長速度相匹配；（6)支 架可控加載生長因子，能夠促進(jìn)種子細(xì)胞的增殖、分化。
[0004] 然而，關(guān)節(jié)骨軟骨再生過程涉及到多因子的誘導(dǎo)和多細(xì)胞表達(dá)作用，以形成骨、礦 化軟骨、未礦化軟骨和膠原纖維等組織，是一個(gè)典型的多因素耦合影響的過程。因此，在進(jìn) 行骨軟骨組織修復(fù)時(shí)，具有均勻?qū)傩缘墓侵Ъ芙Y(jié)構(gòu)往往不能滿足骨缺損部位細(xì)胞的活動(dòng)和 表達(dá)需求。構(gòu)建的再生骨軟骨支架除了要滿足細(xì)胞對支架結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能的要求，更重要 的是能夠在骨組織再生過程中的不同階段，為不同的細(xì)胞提供特定的生長環(huán)境。構(gòu)建一種 具有物理結(jié)構(gòu)(密質(zhì)骨、軟質(zhì)骨等）和化學(xué)成分(生長因子、蛋白質(zhì)等）的梯度結(jié)構(gòu)，能梯度的 可控釋放并輸送誘導(dǎo)多細(xì)胞生長的藥物、蛋白或生長因子的再生骨支架具有非常重要的意 義和應(yīng)用價(jià)值。
[0005] 現(xiàn)有制備再生骨支架修復(fù)骨缺損方面的常用方法有：靜電紡絲工藝、選擇型激光 燒結(jié)工藝和FDM熔融擠出工藝，但是通過這些方法制備出的再生骨支架有著諸多的缺陷。 靜電紡絲工藝制備的再生支架多為無紡狀納米纖維膜，難以成形具有明顯厚度或外形輪廓 的三維立體支架，力學(xué)性能較差，內(nèi)部的孔隙率和孔隙貫通度不佳；選擇性激光燒結(jié)工藝和 熔融擠出工藝在成形支架材料和孔隙結(jié)構(gòu)呈梯度分布的復(fù)合支架方面存在較大的局限性， 無法為細(xì)胞生長、分化提供理想的生物微環(huán)境，致使在再生支架的制備方面仍然存在許多 待解決的難題。
【發(fā)明內(nèi)容】
： 為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明提出一種多藥物可控負(fù)載梯度再生骨支架的制 備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟： 步驟一，成形材料的配置：多藥物可控負(fù)載再生梯度骨支架的構(gòu)建需要宏觀梯度骨支 架和載藥電紡納米纖維的制備，其制備材料有水凝膠材料，如海藻酸鈉和明膠的配比和溫 度對成形宏觀支架的搭接具有重要影響；共混載藥和同軸載藥電紡材料的選擇以及藥物的 選擇和含量，其中藥物加載方式直接影響到藥物的緩釋機(jī)制，實(shí)現(xiàn)支架上藥物的分時(shí)緩釋， 滿足骨缺損修復(fù)不同階段的生物化學(xué)需求； 步驟二，支架制備的路徑規(guī)劃：根據(jù)所需再生骨支架設(shè)計(jì)支架的層高、層數(shù)、纖維間距 以及電紡纖維的沉積位置和時(shí)間等參數(shù)，將一系列參數(shù)輸入上位機(jī)中，利用生物3D打印復(fù) 合成形試驗(yàn)平臺(tái)復(fù)合擠出成形工藝和靜電紡絲技術(shù)制備載藥再生骨支架； 步驟三，制備宏觀骨支架：根據(jù)路徑規(guī)劃和支架梯度結(jié)構(gòu)分析與優(yōu)化結(jié)果，利用微量泵 擠出水凝膠材料和運(yùn)動(dòng)平臺(tái)的運(yùn)動(dòng)，使得支架纖維沉積在運(yùn)動(dòng)平臺(tái)上且每兩層成形支架的 纖維間距呈現(xiàn)梯度變化，后置處理中要設(shè)置合理供料速度、平臺(tái)運(yùn)動(dòng)速度的匹配參數(shù)，即可 得到宏觀骨支架； 步驟四，復(fù)合載藥電紡絲的再生骨支架：在每成形一定層數(shù)的宏觀支架后，運(yùn)動(dòng)平臺(tái)移 動(dòng)到靜電紡絲工位，將靜電紡絲溶液置于注射器中，固定在多噴頭切換裝置上，連接高壓電 源，調(diào)節(jié)系統(tǒng)裝置的有關(guān)參數(shù)，如電壓、供料速度、接收距離、電紡時(shí)間等，根據(jù)前置處理的 路徑規(guī)劃結(jié)果，控制電紡纖維在支架上的沉積位置和靜電紡絲工位多噴頭裝置的切換，實(shí) 現(xiàn)共混載藥和同軸載藥的自由切換，最終得到多種藥物可控負(fù)載的再生骨支架。
[0006] 優(yōu)選地，所述步驟一中的水凝膠材料可以是納米羥基磷灰石、殼聚糖、海藻酸鈉、 明膠、電紡材料明膠、PVA、PCL、殼聚糖，納米羥基磷灰石、殼聚糖、海藻酸鈉、明膠都為可降 解材料，電紡材料明膠、PVA、PCL、殼聚糖都為可降解高分子聚合物。
[0007] 優(yōu)選地，所述步驟一中的藥物為可分為抗生素類和促進(jìn)骨生成蛋白生長因子。
[0008] 優(yōu)選地，所述不靜電紡絲技術(shù)實(shí)現(xiàn)多種藥物的可控負(fù)載，由于共混載藥和同軸載 藥的藥物釋放機(jī)制不同導(dǎo)致藥物的分時(shí)釋放，通過生物3D打印復(fù)合成形試驗(yàn)平臺(tái)的靜電 紡絲工位多噴頭裝置的自由切換，實(shí)現(xiàn)共混電紡和同軸電紡在支架上的復(fù)合，根據(jù)前置處 理的路徑規(guī)劃實(shí)現(xiàn)不同載藥電紡纖維在支架上預(yù)定位置的復(fù)合，實(shí)現(xiàn)多種藥物在支架上的 可控負(fù)載。
[0009] 優(yōu)選地，所述靜電紡絲工位多噴頭裝置的接收距離為10-20cm，電壓為10-15kV， 供料速度為500-1500μLν!ι，擠出成型時(shí)供料速度為0. 2ml/min-0. 4ml/min，接收平臺(tái)水平 運(yùn)動(dòng)速度為15_25mm/s。
[0010] 優(yōu)選地，所述宏觀骨支架的擠出成形呈現(xiàn)梯度結(jié)構(gòu)，通過前置處理改變每層纖維 間距，調(diào)整支架由里向外不同孔隙尺寸的分布，實(shí)現(xiàn)支架孔隙率和孔尺寸的變化，以此調(diào)控 藥物在支架上的釋放和擴(kuò)散。
[0011] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較具有以下突出實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著技術(shù)進(jìn)步：本發(fā)明所述 基于擠出成形工藝和靜電紡絲技術(shù)的藥物可控負(fù)載再生梯度骨支架制備方法，主要目的是 針對人工支架因缺乏梯度物理結(jié)構(gòu)和生化因子而不利于多組織再生的問題，提出了一種具 有材料、結(jié)構(gòu)和生長因子梯度的再生骨支架成形方法。本發(fā)明的宏觀骨支架的成形采用擠 出成形工藝制備具有不同纖維間距或孔隙尺寸的結(jié)構(gòu)梯度；支架的不同層沉積靜電紡絲制 備的載藥纖維，利用宏觀骨支架層間的不同孔隙率形成了生長因子的梯度釋放，提高了支 架與自體骨連接的強(qiáng)度及穩(wěn)定性；該支架的材料具有良好的生物相容性，并且復(fù)合了誘導(dǎo) 因子，在組織重建中有利于誘導(dǎo)支架向骨軟骨多層界面的轉(zhuǎn)化。
【附圖說明】
[0012] 圖1為本發(fā)明使用的生物3D打印復(fù)合成形試驗(yàn)平臺(tái)的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0013] 圖2為本發(fā)明的工藝路徑規(guī)劃示意圖。
[0014] 圖3為宏觀梯度再生骨支架的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0015] 圖4為多藥物可控負(fù)載梯度再生骨支架的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面結(jié)合附圖和實(shí)例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0017] 本發(fā)明多藥物可控負(fù)載梯度再生骨支架的制備方法旨在構(gòu)建物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)成 分上都呈現(xiàn)梯度變化的復(fù)合再生骨支架制備方法，該方法將靜電紡絲技術(shù)與3D打印擠出 成形技術(shù)結(jié)合，通過共混載藥電紡絲和同軸載藥電紡絲技術(shù)構(gòu)建藥物的納米纖維載體，并 將其可控復(fù)合在梯度宏觀骨支架上，實(shí)現(xiàn)多種藥物的可控負(fù)載和后期的梯度釋放。利用靜 電紡絲技術(shù)在生長因子時(shí)間控釋方面展現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢，形成的納米級纖維網(wǎng)結(jié)構(gòu)與細(xì)胞外 基質(zhì)環(huán)境非常接近，能夠?qū)崿F(xiàn)對細(xì)胞迀移，以及細(xì)胞粘附，增殖與生長的雙重介導(dǎo)，其中形 成的共混靜電紡絲載藥可實(shí)現(xiàn)藥物的前期突釋和有效緩釋，滿足需要藥物前期釋放的情 況，同軸納米纖維載體能有效避免生長因子失活和低劑量長期緩釋。通過擠出成形技術(shù)和 載藥靜電紡絲技術(shù)的有效綜合方法，形成由載藥納米纖維膜與生物結(jié)構(gòu)體復(fù)合的藥物控釋 系統(tǒng)；通過宏觀支架擠出成形構(gòu)建結(jié)構(gòu)梯度的骨支架，使得載藥電紡纖維出現(xiàn)差異性的降 解速度，實(shí)現(xiàn)骨再生支架在物理結(jié)構(gòu)的連續(xù)梯度分布和藥物連續(xù)梯度釋放。
[0018] 以上制備方法是基于自主設(shè)計(jì)的生物3D打印復(fù)合成形試驗(yàn)平臺(tái)，整個(gè)平臺(tái)可分 為兩大系統(tǒng)：生物CAD/CAM系統(tǒng)和生物3D打印綜合成形系