組織再生促進(jìn)劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及包含選自由活化星狀細(xì)胞、活化星狀細(xì)胞分解物、MMP14、經(jīng)MMP14處 理的膠原和活化星狀細(xì)胞分泌物構(gòu)成的組中的成分、且用于組織再生促進(jìn)、細(xì)胞分化促進(jìn) 和/或細(xì)胞增殖促進(jìn)的組合物、包含MMP14抑制物質(zhì)且用于抑制細(xì)胞增殖的組合物、及包含 經(jīng)MMP14處理的膠原的細(xì)胞培養(yǎng)基材等。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物體的組織如果受到損傷，則會(huì)進(jìn)行再生以修復(fù)損傷部分，并恢復(fù)其功能。例 如，已知肝臟即使切除一半以上，也會(huì)在短時(shí)間內(nèi)再生，恢復(fù)大致原本的大小和功能。關(guān)于 組織再生的研宄以往重點(diǎn)對(duì)肝臟進(jìn)行，且報(bào)告了各種見(jiàn)解，但關(guān)于組織再生的詳細(xì)機(jī)制仍 有多個(gè)不明之處。認(rèn)為組織的再生中有多種細(xì)胞的復(fù)雜參與，但關(guān)于這些細(xì)胞中的哪一個(gè) 承擔(dān)主要作用，并未得出決定性的見(jiàn)解。
[0003] 通過(guò)對(duì)利用組織染色或細(xì)胞染色等的損傷組織的經(jīng)時(shí)變化、或各種生理活性物 質(zhì)對(duì)組織再生造成的影響等進(jìn)行解析，組織再生機(jī)制逐漸得以闡明。例如，非專利文獻(xiàn) 1中示出了如下假說(shuō)：在小鼠肝部分切除模型中，特定的表型的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞提供介由 VEGFR2(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A受體-2)的內(nèi)皮細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Idl的向上調(diào)節(jié)而引起 肝細(xì)胞增殖，接著通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞自身增殖，由此進(jìn)行肝臟的再生。
[0004] 然而，盡管進(jìn)行了悉心研宄，但組織再生的機(jī)制仍僅有極少的部分得以明確，需要 進(jìn)一步的研宄努力。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0006] 非專利文獻(xiàn)
[0007] 非專利文獻(xiàn) I :Ding et al. ,Nature. 2010Nov 11 ;468 (7321) :310-5

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題
[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種新型的組織再生促進(jìn)劑和組織再生促進(jìn)方法。
[0010] 用于解決技術(shù)問(wèn)題的手段
[0011] 本發(fā)明人們?yōu)榱私鉀Q上述課題進(jìn)行了深入研宄，在此過(guò)程中發(fā)現(xiàn)活化星狀細(xì)胞對(duì) 于組織的再生發(fā)揮了重要的作用、活化星狀細(xì)胞的分泌物會(huì)誘導(dǎo)成為組織再生的核心的干 細(xì)胞的增殖和分化、受到活化星狀細(xì)胞所表達(dá)的MMP14的作用的膠原會(huì)誘導(dǎo)組織實(shí)質(zhì)細(xì)胞 的增殖、以及膠原中存在的RGD序列參與該增殖的誘導(dǎo)，從而完成了本發(fā)明。
[0012] SP，本發(fā)明涉及以下內(nèi)容。
[0013] (1) 一種用于促進(jìn)組織再生的組合物，其包含選自由活化星狀細(xì)胞、活化星狀細(xì)胞 分解物、MMP14、經(jīng)MMP14處理的膠原和活化星狀細(xì)胞分泌物構(gòu)成的組中的成分。
[0014] (2)根據(jù)（1)所述的組合物，其中，組織再生在損害組織或移植組織中發(fā)生。
[0015] (3)根據(jù)⑵所述的組合物，其是在從受到損害或移植之日起4天以內(nèi)被投予。
[0016] (4)根據(jù)⑵所述的組合物，其是在從受到損害或移植之日起1天以內(nèi)被投予。
[0017] (5)根據(jù)（2)~（4)中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，損害選自由組織破壞、炎癥、壞 死、纖維化、手術(shù)侵襲、器官衰竭構(gòu)成的組。
[0018] (6)根據(jù)（1)~（5)中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，組織再生伴有組織干細(xì)胞的分 化和/或增殖。
[0019] (7)根據(jù)（1)~（6)中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，組織再生伴有組織實(shí)質(zhì)細(xì)胞的 增殖。
[0020] (8)根據(jù)⑴~（7)中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，活化星狀細(xì)胞被實(shí)施了使選自 由HGF、EGF、MMP14構(gòu)成的組中的蛋白質(zhì)的表達(dá)增大的處置。
[0021] (9)根據(jù)（1)~（8)中任一項(xiàng)所述的組合物，其是針對(duì)具有組織再生受到抑制的狀 態(tài)的對(duì)象來(lái)使用。
[0022] (10)根據(jù)（9)所述的組合物，其中，組織再生受到抑制的狀態(tài)是選自由炎癥、壞 死、纖維化、器官衰竭、血小板數(shù)量減少、基因異常、去甲腎上腺素減少構(gòu)成的組。
[0023] (11) 一種促進(jìn)對(duì)象的組織再生的方法，其包括將（1)~（10)中任一項(xiàng)所述的組合 物投予至需要其的對(duì)象的工序。
[0024] (12) -種用于干細(xì)胞分化和/或增殖的組合物，其包含選自由活化星狀細(xì)胞、活 化星狀細(xì)胞分解物、MMP14、經(jīng)MMP14處理的膠原和活化星狀細(xì)胞分泌物構(gòu)成的組中的成 分。
[0025] (13) -種使組織干細(xì)胞分化和/或增殖的方法，其包括使選自由活化星狀細(xì)胞、 活化星狀細(xì)胞分解物、MMP14、經(jīng)MMP14處理的膠原和活化星狀細(xì)胞分泌物構(gòu)成的組中的成 分與干細(xì)胞接觸的工序。
[0026] (14) 一種用于促進(jìn)細(xì)胞增殖的組合物，其包含選自由活化星狀細(xì)胞、活化星狀細(xì) 胞分解物、MMP14、經(jīng)MMP14處理的膠原和活化星狀細(xì)胞分泌物構(gòu)成的組中的成分。
[0027] (15) -種使細(xì)胞增殖促進(jìn)的方法，其包括使選自由活化星狀細(xì)胞、活化星狀細(xì)胞 分解物、MMP14、經(jīng)MMP14處理的膠原和活化星狀細(xì)胞分泌物構(gòu)成的組中的成分與細(xì)胞接觸 的工序。
[0028] (16) -種用于抑制細(xì)胞增殖的組合物，其包含抑制MMP14的物質(zhì)。
[0029] (17)根據(jù)（16)所述的組合物，其中，抑制MMP14的物質(zhì)所作用的細(xì)胞是CAF和/ 或腫瘤細(xì)胞。
[0030] (18) -種細(xì)胞培養(yǎng)基材，其包含經(jīng)MMP14處理的膠原。
[0031] (19) 一種細(xì)胞培養(yǎng)容器，其由經(jīng)MMP14處理的膠原被覆。
[0032] 發(fā)明的效果
[0033] 根據(jù)本發(fā)明，不僅能促進(jìn)生物體內(nèi)的組織再生，而且還能促進(jìn)生物體外的組織形 成，因此可期待對(duì)生物學(xué)、醫(yī)學(xué)作出巨大的貢獻(xiàn)。
[0034] 而且，本發(fā)明的組織再生的促進(jìn)在組織再生受到抑制的狀況、例如伴有纖維癥等 疾病的狀況等下尤其有用。
【附圖說(shuō)明】
[0035] 圖1是表示對(duì)肝部分切除大鼠的處置的流程的圖。
[0036] 圖2是表示將肝部分切除后第5天和第10天采集的各組的肝臟的外觀與肝部分 切除前和剛切除后的肝臟進(jìn)行比較的圖。
[0037] 圖3是表示所采集的各組的肝重量的推移的圖表。
[0038] 圖4是表示肝部分切除后第5天采集的肝組織經(jīng)FITC-TUNEL、a -SMA和DAPI共 染色后所得的熒光顯微鏡像的圖。
[0039] 圖5是表示肝部分切除后第5天采集的肝組織經(jīng)FITC-TUNEL、a -SMA和DAPI共 染色后所得的熒光顯微鏡像中的a -SM陽(yáng)性TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量的圖。
[0040] 圖6是表示肝部分切除后第5天采集的肝組織經(jīng)Ki67和DAPI共染色后所得的熒 光顯微鏡像的圖。
[0041] 圖7是表示肝部分切除后第5天采集的肝組織經(jīng)Ki67和DAPI共染色后所得的熒 光顯微鏡像中的Ki67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的圖。
[0042] 圖8是表示肝部分切除后第5天采集的肝組織經(jīng)⑶133和DAPI共染色后所得的 熒光顯微鏡像的圖。
[0043] 圖9是表示對(duì)例3的各組實(shí)施的處置的概要的圖。
[0044] 圖10是表示將所采集的各組的肝臟的外觀與剛進(jìn)行肝部分切除后（第0天）的 肝臟進(jìn)行比較的圖。
[0045] 圖11是表示將所采集的各組的肝臟的重量與剛進(jìn)行肝部分切除后（第0天）的 肝臟進(jìn)行比較的圖表。
[0046] 圖12是表示肝部分切除后的肝組織中的a -SM陽(yáng)性細(xì)胞的經(jīng)時(shí)變化的圖。
[0047] 圖13是表示肝部分切除后的肝組織中的a -SMA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的經(jīng)時(shí)變化的圖 表。
[0048] 圖14是表示靜止型肝星狀細(xì)胞（上圖）和活性型肝星狀細(xì)胞（下圖）的顯微鏡 像的圖。
[0049] 圖15是表示干細(xì)胞與星狀細(xì)胞的接觸共培養(yǎng)中的GFP/白蛋白兩陽(yáng)性群落的顯微 鏡像的圖。
[0050] 圖16是表示在干細(xì)胞與星狀細(xì)胞的接觸共培養(yǎng)中添加了 EGF和HGF時(shí)的GFP/白 蛋白兩陽(yáng)性群落的顯微鏡像的圖。
[0051] 圖17是表示干細(xì)胞與星狀細(xì)胞的接觸共培養(yǎng)中的GFP/白蛋白兩陽(yáng)性群落數(shù)量的 圖表。
[0052] 圖18是表示干細(xì)胞與星狀細(xì)胞的接觸共培養(yǎng)中的GFP/白蛋白兩陽(yáng)性群落的面積 的圖表。
[0053] 圖19是表示干細(xì)胞與星狀細(xì)胞的非接觸共培養(yǎng)中的GFP/白蛋白兩陽(yáng)性群落的面 積的圖表。
[0054] 圖20是以吸光度表示干細(xì)胞與星狀細(xì)胞的非接觸共培養(yǎng)中的GFP/白蛋白兩陽(yáng)性 細(xì)胞數(shù)量的增殖的圖表。
[0055] 圖21是表示肝部分切除后的肝組織中的DNA合成的經(jīng)時(shí)變化的顯微鏡像。
[0056] 圖22是表示肝部分切除后的肝組織中的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞的比例的經(jīng)時(shí)變化的圖 表。
[0057] 圖23是表示肝部分切除后的肝組織中的DNA合成的經(jīng)時(shí)變化的顯微鏡像。
[0058] 圖24是表示肝部分切除后的肝組織中的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞的比例的經(jīng)時(shí)變化的圖 表。
[0059] 圖25是表示共培養(yǎng)肝細(xì)胞與星狀細(xì)胞時(shí)的BrdU陽(yáng)性肝細(xì)胞的顯微鏡像。
[0060] 圖26是表示共培養(yǎng)肝細(xì)胞與星狀細(xì)胞時(shí)的BrdU陽(yáng)性肝細(xì)胞的比例的圖表。
[0061] 圖27是表示在實(shí)施了各種處理的膠原上培養(yǎng)肝細(xì)胞時(shí)的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞的顯微鏡 像。
[0062] 圖28是表示在實(shí)施了各種處理的膠原上培養(yǎng)肝細(xì)胞時(shí)的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞的比例的 圖表。
[0063] 圖29是表示共培養(yǎng)肝細(xì)胞與已敲減MMP14和/或HGF的星狀細(xì)胞時(shí)的BrdU陽(yáng)性 肝細(xì)胞的顯微鏡像。
[0064] 圖30是表示共培養(yǎng)肝細(xì)胞與已敲減MMP14和/或HGF的星狀細(xì)胞時(shí)的BrdU陽(yáng)性 肝細(xì)胞的比例的圖表。
[0065] 圖31是表示在MMP14處理膠原上、在存在R⑶肽的條件下培養(yǎng)肝細(xì)胞時(shí)的BrdU 陽(yáng)性細(xì)胞的顯微鏡像。
[0066] 圖32是表示在MMP14處理膠原上、在存在R⑶肽的條件下培養(yǎng)肝細(xì)胞時(shí)的BrdU 陽(yáng)性細(xì)胞的比例的圖表。
【具體實(shí)施方式】
[0067] 本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種用于促進(jìn)組織再生的組合物，其包含選自由活化星狀 細(xì)胞、活化星狀細(xì)胞分解物、MMP14、經(jīng)MMP14處理的膠原和活化星狀細(xì)胞分泌物構(gòu)成的組 中的成分。
[0068] 活化星狀細(xì)胞可以通過(guò)傳代培養(yǎng)從生物體分離出的星狀細(xì)胞而獲得。已知星狀細(xì) 胞存在于肝臟、胰腺、腎臟、腸道、肺等各種組織中（Zhao and Burt, J Mol Histol. 2007Mar; 38(1) :53-64)，可以利用其中的任一種。星狀細(xì)胞的分離可以使用已知的任意方法來(lái)進(jìn)行。 肝星狀細(xì)胞的分離方法的具體例例示于后述的例5(1)中?；罨菭罴?xì)胞的特征在于a SM 的表達(dá)，可以將其作為標(biāo)記物進(jìn)行分選。
[0069] 活化星狀細(xì)胞可以被實(shí)施了使選自由HGF、EGF、MMP14構(gòu)成的組中的蛋白質(zhì)的表 達(dá)增大的處置。作為這樣處置，并無(wú)限定，例如可以列舉出將編碼所述蛋白質(zhì)的基因?qū)牖?化星狀細(xì)胞。編碼HGF、EGF和MMP14的基因是已知的，而且基因的導(dǎo)入法也是本技術(shù)領(lǐng)域 所熟知的。
[0070] 活化星狀細(xì)胞分解物可通過(guò)利用包含物理性和/或化學(xué)性方法的各種方法對(duì)活 化星狀細(xì)胞進(jìn)行分解而獲得。關(guān)于分解，可以使用將細(xì)胞分解的已知的任意的方法，例如 滲透壓沖擊法、冷凍熔解法、表面活性劑的使用、酶消化法、超聲波處理、弗氏細(xì)胞壓碎器、 利用研缽的粉碎、利用均化器的破碎、利用玻璃珠的破碎等。分解方法優(yōu)選不會(huì)使蛋白質(zhì)變 性、或變性程度輕的方法。通過(guò)使用這樣的方法，可獲得在細(xì)胞膜上表達(dá)的MMP14而不會(huì)損 及其功能。而且，活化星狀細(xì)胞分解物優(yōu)選含有細(xì)胞膜成分。
[0071] MMP14(也稱為MT1-MMP)是在細(xì)胞膜上表達(dá)的MMP。MMP14可以作用于膠原I。通 過(guò)本發(fā)明人可知，MMP14對(duì)膠原I的作用與細(xì)胞的增殖有很深的關(guān)系。
[0072] 本發(fā)明的MMP14不僅包括在細(xì)胞膜上表達(dá)的MMP14,而且還包括已從細(xì)胞膜游離 出的MMP14。MMP14可以天然存在，也可以人工制作。因此，MMP14包括重組MMP14。游離型 的 MMP14 是已知的（例如 Jo et al.，Biochem J.2000Feb l;345Pt 3:511-9 等），也已市 售（例如 R&D Systems, Cat No. 918-MP-0KK918-MPN-010 等）。MMP14 的氨基酸和對(duì)其進(jìn) 行編碼的堿基序列是已知的（例如人MM