用于耐藥性乳腺癌預(yù)后和治療的作為新治療助劑和生物標(biāo)志物的miRNA的制作方法
【專利說明】用于耐藥性乳腺癌預(yù)后和治療的作為新治療助劑和生物標(biāo) 志物的miRNA
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求于2012年11月16日提交的美國臨時(shí)專利申請No. 61/727,481的優(yōu) 先權(quán)權(quán)益，其通過引用以其整體并入本文。
[0003] 說明書 [0004] 發(fā)明背景
[0005] A.發(fā)明領(lǐng)域
[0006] 本發(fā)明涉及微RNA(miRNA)用于治療癌癥的用途，以及這些組合物用于治療癌癥 的用途。
[0007] B.相關(guān)領(lǐng)域描述
[0008] 所有乳腺癌中大約15 %至20 %是三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC)。這些癌癥通常表現(xiàn)出不同的、侵襲性轉(zhuǎn)移方式。接受TNBC診斷的那些的預(yù) 后通常是不良的，并且隨之不成比例數(shù)目的乳腺癌死亡。雖然在TNBC疾病的早期階段化學(xué) 治療響應(yīng)率（response rate)更好，但是超過60%的TNBC患者發(fā)生化學(xué)抗性，這導(dǎo)致早期 復(fù)發(fā)和縮短的存活。
[0009] miRNA是小的、非蛋白質(zhì)編碼RNA，其在基因調(diào)控中起著廣泛作用。超過60%的人 蛋白質(zhì)編碼基因的信使RNA可被miRNA靶向，其在許多人細(xì)胞類型中大量存在（Friedman 等，2009)。人類基因組編碼超過1000個(gè)miRNA(在曼徹斯特大學(xué)miRBase中列出了超過 1000 個(gè)智人（Homo sapiens)miRNA)〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 在一種情況下，公開了用于減少癌細(xì)胞生長的方法，所述方法包括向?qū)ο笫┯糜?效量的包含hsa-miR-204或其同源物的組合物，所述對象具有或疑似具有hsa-miR-204或 其同源物表達(dá)降低或顯著降低的癌細(xì)胞。在某些方面中，在所述對象的癌細(xì)胞中腦源性神 經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF)或埃茲蛋白是過表達(dá)或顯著地 過表達(dá)的，所述對象具有或疑似具有hsa-miR-204或其同源物表達(dá)降低或顯著降低的癌細(xì) 胞。
[0011] 在一些實(shí)施方案中，所述對象是哺乳動物。在某些方面中，所述對象是人。所述對 象可患有癌癥，例如乳腺癌、卵巢癌或兒科腎腫瘤。在某些方面中，所述患者的乳腺癌細(xì)胞 是三陰性乳腺癌（TNBC)細(xì)胞。在某些方面中，癌細(xì)胞生長是轉(zhuǎn)移性的。
[0012] 在一些實(shí)施方案中，所公開的用于減少癌細(xì)胞生長的方法還包括測定對象的細(xì)胞 中hsa-miR-204或其同源物的水平。在一些相關(guān)的實(shí)施方案中，所公開的方法是用于鑒 定可能從用于減少癌細(xì)胞生長的治療受益的患者，所述方法包括測定所述對象的細(xì)胞中 hsa-miR-204或其同源物的水平。
[0013] 在某些方面中，通過使用基于定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR)的方法 或基于陣列雜交的方法來測定hsa-miR-204或其同源物的水平。在一些方面中，測定 hsa-miR-204或其同源物的水平是測定從對象獲得的血液樣品中hsa-miR-204或其同源物 的水平。在一些方面中，測定出從對象獲得的血液樣品中hsa-miR-204或其同源物的水平 處于降低的水平。
[0014] 在一些實(shí)施方案中，包含hsa-miR-204或其同源物的組合物配制成用于全身施 用。在某些方面中，通過靜脈內(nèi)注射來施用該組合物。在某些另外的方面中，所述包含 hsa-miR-204或其同源物的組合物還包含基于脂質(zhì)的遞送載劑（vehicle)或基于納米顆粒 的遞送載劑。
[0015] 在另一些實(shí)施方案中，還向?qū)ο笫┯冒诙钚詣┑慕M合物。在另一些方面中， 所述第二活性劑是細(xì)胞毒性化學(xué)治療劑、納米生物綴合物（nanobioconjugate)或者除了 hsa-miR-204或其同源物之外的miRNA。在某些另外的方面中，所述細(xì)胞毒性化學(xué)治療劑包 括紫杉烷，并且在某些另外的方面中，所述紫杉烷是紫杉醇（paclitaxel)。
[0016] 在包括施用包含第二活性劑的組合物的一些實(shí)施方案中，同時(shí)施用包含 hsa-miR-204或其同源物的組合物與包含第二活性劑的組合物。在一些另外的實(shí)施方案 中，在施用包含第二活性劑的組合物之前或之后施用包含hsa-miR-204或其同源物的組合 物。在某些方面中，包含hsa-miR-204或其同源物的組合物與包含第二活性劑的組合物之 間的施用時(shí)間間隔可以為1天至30天，或者其可以為0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、 0·9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29、30或更多小時(shí)或天，或者其中可推導(dǎo)出的任意整數(shù)。
[0017] 在還包括施用包含第二活性劑的組合物的某些實(shí)施方案中，在施用包含 hsa-miR-204或其同源物的組合物之前施用包含第二活性劑的組合物。在某些另外的方面 中，其包括在包含hsa-miR-204或其同源物的組合物之前施用包含第二活性劑的組合物， 癌細(xì)胞已經(jīng)變得對所述第二活性劑有抗性。在某些另外的方面中，在包含hsa-miR-204或 其同源物的組合物之前施用包含第二活性劑的組合物，并且所述第二活性劑是化學(xué)治療藥 物。在某些另外的方面中，所述第二活性劑是紫杉酚（taxol)。在某些另外的方面中，所述 第二活性劑是紫杉醇。
[0018] 在上述方法的一些實(shí)施方案中，包含hsa-miR-204或其同源物的組合物取自包含 可藥用載體的制劑。在一些方面中，所述制劑還滿足對于無菌、熱原和顆粒物質(zhì)或其他污染 物的藥典要求，或者將其配制成用于全身施用，或者既滿足上述藥典要求也將其配制成用 于全身施用。
[0019] 還公開了用于篩選潛在致敏物miRNA的方法，當(dāng)其被抑制時(shí)，增加在亞致死濃度 的治療活性劑中培養(yǎng)的癌細(xì)胞系細(xì)胞的生存力，所述方法包括：在含有miRNA抑制劑的培 養(yǎng)基中培養(yǎng)癌細(xì)胞系細(xì)胞一段時(shí)間，所述含有miRNA抑制劑的培養(yǎng)基包含亞致死濃度的治 療活性劑以及候選致敏物miRNA的抑制劑；在缺乏miRNA抑制劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)癌細(xì)胞系 細(xì)胞相同的一段時(shí)間，所述缺乏miRNA抑制劑的培養(yǎng)基包含亞致死濃度的治療活性劑但是 沒有添加所述候選致敏物miRNA的抑制劑；并且在一段時(shí)間之后，測定含miRNA抑制劑細(xì) 胞群和缺乏miRNA抑制劑細(xì)胞群的生存力，其中如果所述含miRNA抑制劑細(xì)胞群（用治療 活性劑和候選致敏物miRNA抑制劑培養(yǎng)）的生存力顯著高于所述缺乏miRNA抑制劑細(xì)胞群 (用治療活性劑但是沒有添加候選致敏物miRNA抑制劑培養(yǎng)）的生存力，則將所述候選致敏 物miRNA鑒定為潛在致敏物miRNA。
[0020] 在用于篩選的該方法的某些方面中，所述潛在致敏物miRNA是hsa-miR-204、 hsa-miR-185、hsa-miR-211、hsa-miR-367_5p(還稱為 hsa-miR-367 * )或 hsa_miR-133A， 或者這些miRNA之任意一種的同源物。在某些方面中，所述治療活性劑的亞致死濃度是以 其培養(yǎng)72小時(shí)之后，80%的所述癌細(xì)胞系細(xì)胞保持活力的濃度。在某些另外的方面中，所 述治療活性劑是例如在2nM至SnM亞致死濃度下的紫杉酚和/或其他化學(xué)治療藥物。在某 些另外的方面中，所述癌細(xì)胞系細(xì)胞是TNBC細(xì)胞。
[0021] 還公開了用于篩選潛在脫敏物miRNA的方法，當(dāng)其被抑制時(shí)，降低在亞致死濃度 的治療活性劑中培養(yǎng)的癌細(xì)胞系細(xì)胞的生存力，所述方法包括：在含有miRNA抑制劑的培 養(yǎng)基中培養(yǎng)癌細(xì)胞系細(xì)胞一段時(shí)間，所述含有miRNA抑制劑的培養(yǎng)基包含亞致死濃度的治 療活性劑以及候選脫敏物miRNA的抑制劑；在缺乏miRNA抑制劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)癌細(xì)胞系 細(xì)胞相同的一段時(shí)間，所述缺乏miRNA抑制劑的培養(yǎng)基包含亞致死濃度的治療活性劑但是 沒有添加所述候選脫敏物miRNA的抑制劑；并且在一段時(shí)間之后，測定含miRNA抑制劑細(xì) 胞群和缺乏miRNA抑制劑細(xì)胞群的生存力，其中如果所述含miRNA抑制劑細(xì)胞群（用治療 活性劑和候選脫敏物miRNA抑制劑培養(yǎng)）的生存力顯著低于所述缺乏miRNA抑制劑細(xì)胞群 (用治療活性劑但是沒有添加候選脫敏物miRNA抑制劑培養(yǎng)）的生存力，則將候選脫敏物 miRNA鑒定為潛在脫敏物miRNA。
[0022] 在用于篩選的該方法的某些方面中，所述潛在脫敏物miRNA是hsa-miR-129-3p、 hsa-miR-296-5p、hsa-miR-216a、hsa-miR-1237、hsa-miR-1915 *、hsa_miR-320d，或者這些 miRNA之任意一種的同源物。在某些方面中，所述治療活性劑的亞致死濃度是以其培養(yǎng)72 小時(shí)之后，80%的所述癌細(xì)胞系細(xì)胞保持活力的濃度。在某些另外的方面中，所述治療活性 劑是例如在2nM至SnM的亞致死濃度下的紫杉酚和/或其他化學(xué)治療藥物。在某些另外的 方面中，所述癌細(xì)胞系細(xì)胞是TNBC細(xì)胞。
[0023] 在一些實(shí)施方案中，公開了用于減少癌細(xì)胞生長的方法，其包括向?qū)ο笫┯糜行?量的包含致敏物miRNA或致敏物miRNA之同源物的組合物，所述對象具有或疑似具有致敏 物miRNA表達(dá)降低或顯著降低的癌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，公開了用于減少癌細(xì)胞生長 的方法，所述方法包括向?qū)ο笫┯糜行Я康陌撁粑飉iRNA抑制劑或脫敏物miRNA之同 源物抑制劑的組合物，所述對象具有或疑似具有脫敏物miRNA表達(dá)顯著增加的癌細(xì)胞。
[0024] 在一些實(shí)施方案中，公開了用于鑒定可能從用于減少癌細(xì)胞生長的治療受益的對 象的方法，所述方法包括測定所述對象的細(xì)胞中致敏物miRNA或致敏物miRNA同源物的水 平。在某些方面中，該方法的致敏物miRNA是hsa-miR-204、hsa-miR-185、hsa-miR-211、 hsa-miR-367_5p (還稱為 hsa-miR-367 * )、hsa_miR-133A 或這些致敏物 miRNA 之一的同 源物。
[0025] 在一些實(shí)施方案中，公開了用于鑒定可能從用于減少癌細(xì)胞生長的治療受益的 對象的方法，所述方法包括測定所述對象的細(xì)胞中脫敏物miRNA或脫敏物RNA同源物 的水平。在某些方面中，該方法的脫敏物miRNA是hsa-miR-129-3p、hsa-miR-296-5p、 hsa_miR-216a、hsa-miR-1237、hsa-miR-1915 *、hsa_miR-320d 或這些脫敏物 miRNA 之一 的同源物。
[0026] 在表 1 中提供了 致敏物 miRNA hsa-miR-204、hsa-miR-185、hsa-miR-211、 hsa-miR-367-5p(還稱為 hsa-miR-367 * )和 hsa-miR-133A( SP， hsa-miR-133A-2)， 以及脫敏物 miRNA hsa-miR-129-3p ( SP，hsa-miR-129-l 的-3p 區(qū)）、hsa-miR-296-5p、 hsa_miR-216a、hsa-miR-1237、hsa-miR-1915 * 和 has_miR-320d 之莖環(huán)序列的序列和 SEQ ID NO。
[0027] 當(dāng)提及miRNA使用時(shí)，術(shù)語"同源物"是指像所提及的miRNA那樣起作用（例如，像 所提及的miRNA那樣能夠靶向基因表達(dá)）的寡核苷酸。同源物通常具有與所提及的miRNA 在性質(zhì)（例如，序列和結(jié)構(gòu)）上的相似性水平，根據(jù)本公開內(nèi)容，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可將 其鑒定為所提及序列的同源物（例如，使用miRNA同源物鑒定工具，例如，在默認(rèn)/嚴(yán)格參 數(shù)下的 miRNAminer ;參見，例如，可在 groups, csail. mit. edu/pag/mirnaminer/ 上在線獲 得的miRNAminer工具；還參見Artzi等，2008) 〇
[0028] 除非另外指明（例如，提及序列同源性或比對），對于化合物，本文表達(dá)的百分比 值是按重量計(jì)的重量并且與總組合物有關(guān)。
[0029] 術(shù)語"顯著地"（例如，當(dāng)提及例如"減少"或"增加"；"較低"或"較高"；"抑制" 或"過表達(dá)"；"未能超過"或"超過"或者類似類型的限定語而使用時(shí)）是指參照或測試樣 品中的水平，其至少為大于測定標(biāo)準(zhǔn)誤差之幅度的幅度，所述測定用于評估限定語所應(yīng)用 的特征。在一些情況下，參照或測試樣品的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性可與小于0. 25、0. 15、0. 10、0. 05、 0· 025、0· 01