一種具有天然水平糖胺聚糖的脫細(xì)胞基質(zhì)及其制備與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于組織工程領(lǐng)域，特別涉及一種具有天然水平糖胺聚糖的脫細(xì)胞基質(zhì)及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]在組織工程領(lǐng)域，載體支架材料的制備是進(jìn)行組織工程構(gòu)建的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。其中脫細(xì)胞基質(zhì)載體具有天然超微三維結(jié)構(gòu)、豐富的細(xì)胞外基質(zhì)成分及低免疫源性等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用。良好的脫細(xì)胞基質(zhì)載體應(yīng)具有以下特征:①免疫活性物質(zhì)被有效去除，生物相容性良好；②天然的結(jié)構(gòu)和成分得到了有效的保護(hù)，細(xì)胞外基質(zhì)成分保留程度高。就目前國(guó)內(nèi)外脫細(xì)胞基質(zhì)制備情況看:所得脫細(xì)胞基質(zhì)大體結(jié)構(gòu)保留完整；膠原纖維，層粘連蛋白基本完整保留；彈力蛋白保留率小于40%;糖胺聚糖丟失率大于50%。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們可以發(fā)現(xiàn):目前制備的脫細(xì)胞基質(zhì)雖然能獲得較好生物相容性，但其原有膠原網(wǎng)絡(luò)與部分蛋白質(zhì)(纖維連接蛋白、層粘連蛋白和彈性蛋白等)被破壞，糖胺聚糖等天然成分大量流失，導(dǎo)致其生物活性、熱穩(wěn)定性、力學(xué)強(qiáng)度和耐降解性能等生物學(xué)功能常不足以滿足臨床需要。因此，對(duì)脫細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行改性處理成為了一大關(guān)鍵問題。
[0003]現(xiàn)行的脫細(xì)胞基質(zhì)改性方法著眼于脫細(xì)胞基質(zhì)生物學(xué)功能的改良。主要分為兩大類:表面刻蝕法和交聯(lián)改性法。表面刻蝕法是指利用物理或化學(xué)方法(如光、酸、堿)改變基質(zhì)表面的粗糙度，增加脫細(xì)胞基質(zhì)的細(xì)胞粘附性。其缺點(diǎn)在于:損壞了脫細(xì)胞基質(zhì)的表面天然結(jié)構(gòu)，基質(zhì)表面的信號(hào)結(jié)合位點(diǎn)丟失，影響了細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境。交聯(lián)改性法是目前最常用的脫細(xì)胞基質(zhì)改性方法，具體還可分為:氧化法、交聯(lián)劑法、物理法和酶法。其中氧化法是指利用光或高能輻照使脫細(xì)胞基質(zhì)中的氨基酸活化并重新結(jié)合，改善了脫細(xì)胞基質(zhì)的熱穩(wěn)定性和生物相容性，并增強(qiáng)了機(jī)械強(qiáng)度。此外，這種方法不需使用添加劑、可控性高且毒性較小。但此法缺點(diǎn)在于:適用范圍小并且照射過程可能會(huì)導(dǎo)致基質(zhì)中的蛋白活性物質(zhì)變性失活。交聯(lián)劑法是指使用不同類型的交聯(lián)劑與脫細(xì)胞基質(zhì)交聯(lián)，增強(qiáng)脫細(xì)胞基質(zhì)的力學(xué)強(qiáng)度并改善其體內(nèi)降解性能。其缺點(diǎn)在于:交聯(lián)劑的殘留對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)造成影響，還會(huì)使脫細(xì)胞基質(zhì)產(chǎn)生一定溶血性。物理法是指利用分子纏繞、鹽鍵、氫鍵及疏水作用使物理型交聯(lián)劑在脫細(xì)胞基質(zhì)上形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，改善了脫細(xì)胞基質(zhì)的力學(xué)強(qiáng)度及抗降解性能。這種方法安全隱患小，但物理型交聯(lián)劑的選擇難度較大，并且對(duì)于物理交聯(lián)型水凝膠，分子間的纏繞、疏水相互作用或離子鍵合區(qū)域也會(huì)形成簇團(tuán)結(jié)構(gòu)，因此造成凝膠的不均勻性，同時(shí)自由鏈端和鏈環(huán)也會(huì)產(chǎn)生瞬時(shí)的網(wǎng)絡(luò)缺陷。酶法是利用相關(guān)酶(轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、辣根過氧化物酶、酪氨酸酶、賴氨酰氧化酶等)催化脫細(xì)胞基質(zhì)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，改善其生物相容性。這種方法優(yōu)點(diǎn)在于:高效、高選擇性、交聯(lián)速率可控、反應(yīng)條件溫和等，但其高選擇性也限制了在交聯(lián)改性中的應(yīng)用范圍。
[0004]上述方法的共同特征在于:通過物理、化學(xué)和酶的方法改變脫細(xì)胞基質(zhì)中生物活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使其生物活性、熱穩(wěn)定性、力學(xué)強(qiáng)度和耐降解性能得到提升。但均存在著一個(gè)共同的問題:脫細(xì)胞過程中丟失的生物活性成分未得到補(bǔ)充。其中，天然細(xì)胞外基質(zhì)主要成分之一:糖胺聚糖在脫細(xì)胞過程中大量流失，然而，糖胺聚糖對(duì)維持脫細(xì)胞基質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、對(duì)細(xì)胞的粘附和迀移具有重要意義。它具有良好的保水作用，能夠保護(hù)細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原纖維不受損害，維持細(xì)胞外基質(zhì)的功能活性，特別地，在角膜中，糖胺聚糖(主要為硫酸角質(zhì)素)的存在可以穩(wěn)固膠原緊密規(guī)則排列，這與維持其透光性密切相關(guān)。而在軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中，糖胺聚糖(主要為硫酸軟骨素)的親水性可以使軟骨增厚，并增加關(guān)節(jié)內(nèi)的滑液量。并且糖胺聚糖對(duì)各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(如:生長(zhǎng)因子等)、細(xì)胞因子等有固定和吸附的作用，可以根據(jù)周圍細(xì)胞的需要對(duì)其進(jìn)行調(diào)控。然而，糖胺聚糖的大量流失使脫細(xì)胞基質(zhì)的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，特別地，糖胺聚糖的存留量直接關(guān)系到脫細(xì)胞角膜體內(nèi)移植后的透明時(shí)間。加之，脫細(xì)胞基質(zhì)中細(xì)胞因子及各種生長(zhǎng)因子所剩無幾，種子細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)無法建立有效的營(yíng)養(yǎng)供求平衡，使細(xì)胞在體內(nèi)惡劣的微環(huán)境下的活性無法維持。因此，對(duì)脫細(xì)胞基質(zhì)中糖胺聚糖含量的檢測(cè)是十分關(guān)鍵且必要的。就目前脫細(xì)胞產(chǎn)品的制備結(jié)果看，脫細(xì)胞產(chǎn)品糖胺聚糖剩余量不足50%。因此，我們不難發(fā)現(xiàn)，本領(lǐng)域相關(guān)產(chǎn)品均存在著一個(gè)不易克服的共同缺陷:改性后的脫細(xì)胞基質(zhì)無法恢復(fù)脫細(xì)胞過程中大量流失的生物學(xué)活性成分:糖胺聚糖，直接影響了脫細(xì)胞產(chǎn)品的超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞外基質(zhì)成分，致使產(chǎn)品的生物學(xué)功能改變。
[0005]綜上所述，滿足臨床應(yīng)用要求的脫細(xì)胞基質(zhì)不但需要足夠的生物力學(xué)強(qiáng)度和良好的生物相容性，還需要要求其在結(jié)構(gòu)和成分上與天然細(xì)胞外基質(zhì)相似。如何通過改性脫細(xì)胞基質(zhì)使其恢復(fù)天然細(xì)胞外基質(zhì)生物活性成分是目前制約該類產(chǎn)品發(fā)展的關(guān)鍵問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種具有天然水平糖胺聚糖的脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法。
[0007]本發(fā)明的另一目的在于提供通過上述制備方法制備得到的具有天然水平糖胺聚糖的脫細(xì)胞基質(zhì)。
[0008]本發(fā)明的再一目的在于提供上述具有天然水平糖胺聚糖的脫細(xì)胞基質(zhì)的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0010]一種具有天然水平糖胺聚糖的脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法，包含如下步驟:
[0011](I)對(duì)天然生物組織進(jìn)行脫細(xì)胞處理，得到脫細(xì)胞基質(zhì)；
[0012](2)檢測(cè)脫細(xì)胞基質(zhì)中糖胺聚糖的丟失量；
[0013](3)借助脫細(xì)胞基質(zhì)中天然成分接入補(bǔ)充糖胺聚糖，得到具有天然水平糖胺聚糖的脫細(xì)胞基質(zhì)。
[0014]步驟(I)中所述的天然生物組織為異種、同種異體或自體的天然脂肪組織、軟骨組織、血管組織、真皮組織、肝臟組織、腎臟、輸尿管和生物膜中的至少一種；其中生物膜可為心包膜、角膜、腹膜、羊膜、膀胱粘膜、腸系膜和小腸粘膜中的至少一種；
[0015]步驟(I)中所述的脫細(xì)胞處理優(yōu)選包括如下步驟:利用制備脫細(xì)胞基質(zhì)的方法中的至少一種對(duì)天然生物組織進(jìn)行脫細(xì)胞處理；
[0016]所述的制備脫細(xì)胞基質(zhì)的方法優(yōu)選包含如下方法:通過酶破壞細(xì)胞得到脫細(xì)胞基質(zhì)的酶消化法；通過物理方式破壞細(xì)胞得到脫細(xì)胞基質(zhì)的物理法；通過化學(xué)試劑裂解細(xì)胞得到脫細(xì)胞基質(zhì)的化學(xué)法；
[0017]所述的酶優(yōu)選包括蛋白酶、核酸酶和磷脂酶等中的至少一種；蛋白酶能水解細(xì)胞蛋白質(zhì)成分，核酸酶能水解核酸，磷脂酶能破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)；
[0018]所述的物理方式優(yōu)選包括冷凍、高壓、超聲波、機(jī)械震蕩、反復(fù)凍融和滲透壓改變等中的至少一種；
[0019]所述的化學(xué)試劑優(yōu)選包括酸、堿、螯合劑和表面活性劑等中的至少一種；
[0020]所述的脫細(xì)胞處理更優(yōu)選包括如下步驟:對(duì)天然生物組織進(jìn)行預(yù)處理，使其處于無菌狀態(tài)；接著利用制備脫細(xì)胞基質(zhì)的方法中的至少一種對(duì)天然生物組織進(jìn)行脫細(xì)胞處理；
[0021 ] 所述的預(yù)處理包括如下的步驟A，或步驟A和步驟B，或步驟A?C:
[0022]A、用含抗生素的生理緩沖液對(duì)天然生物組織進(jìn)行清洗、消毒、分離，有利于保持無菌狀態(tài)；
[0023]B、用低滲或等滲溶液浸泡用抗生素處理過的天然生物組織，有利于讓下一步驟的脫細(xì)胞液更好地作用于天然生物組織，提高脫細(xì)胞效率；
[0024]C、震蕩和調(diào)節(jié)洗滌溫度，超聲波處理，作用同步驟B ;
[0025]步驟(3)中所述的接入方法優(yōu)選為物理共混、化學(xué)交聯(lián)、離子鍵合和化學(xué)接枝中的一種或一種以上；
[0026]所述的物理共混是利用高分子試劑的分子纏繞、鹽鍵、氫鍵及疏水作用使糖胺聚糖分布于脫細(xì)胞基質(zhì)的表面以及內(nèi)部；
[0027]所述的高分子試劑優(yōu)選包含水凝膠、聚電解質(zhì)中的一種或兩種；
[0028]所述的化學(xué)交聯(lián)是在交聯(lián)劑的作用下，脫細(xì)胞基質(zhì)中大分子與糖胺聚糖鏈間通過化學(xué)鍵聯(lián)結(jié)起來，形成網(wǎng)狀或體形結(jié)構(gòu)；
[0029]所述的交聯(lián)劑優(yōu)選包含1-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)_碳酰二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、1，1-羰基二咪唑、京尼平、氧化海藻酸鈉、戊二醛、多醛基葡聚糖和辣根過氧化物酶中的至少一種；
[0030]所述的離子鍵合是在脫細(xì)胞基質(zhì)上接入高分子，通過高分子與糖胺聚糖間的離子鍵反應(yīng)，將糖胺聚糖接入脫細(xì)胞基質(zhì)中；
[0031]所述的高分子優(yōu)選包括鹽酸十六烷基胺和聚氨酯中的至少一種；
[0032]所述的化學(xué)接枝是利用高分子試劑，使脫細(xì)胞基質(zhì)表面的反應(yīng)基團(tuán)(如:氨基)與糖胺聚糖直接或間接