一種將膠原和纖維蛋白混合的組織封閉劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種將膠原和纖維蛋白混合的組織封閉劑，以及制備該組織封閉劑的 方法，更具體地，本發(fā)明在于補(bǔ)充強(qiáng)度和降解性，而這被指出是市場中的血纖蛋白黏合劑的 弱點(diǎn)。即，本發(fā)明涉及一種組織封閉劑，當(dāng)該組織封閉劑與細(xì)胞有親和性時(shí)，將活化包含于 血液中的血小板以誘導(dǎo)組織再生，因此可以顯著改善產(chǎn)品的質(zhì)量和可靠性以滿足作為使用 者的消費(fèi)者的各種需求。
【背景技術(shù)】
[0002] 如所周知，醫(yī)療封閉劑已被應(yīng)用到范圍從手術(shù)黏著（surgical adhension)和附著 到止血的各種領(lǐng)域，且有很長歷史。由于醫(yī)療封閉劑材料被直接施用于人類組織，需要使用 生物相容性材料。由于醫(yī)療封閉劑材料可以基本上流入體液或血液中，需要醫(yī)療封閉劑材 料是嚴(yán)格生物相容的和生物可降解的，能夠是無菌的，并且不應(yīng)表現(xiàn)出毒性和損害。另外， 對于選擇封閉劑材料重要的是與生物組織具有高親和性，甚至在施用進(jìn)組織中之后，從而 不干擾再生至原組織中。
[0003] 目前，氰基丙烯酸酯、聚氨酯、明膠、纖維蛋白等作為醫(yī)療封閉劑材料被應(yīng)用于產(chǎn) 品。醫(yī)療封閉劑已普遍被用于多個(gè)領(lǐng)域，例如皮膚、血管、消化器官、腦神經(jīng)、整形外科、骨科 等。考慮到傷口，需要這樣的封閉劑以具有在潮濕環(huán)境中迅速的粘合強(qiáng)度，是可滅菌和無毒 的，并且不干擾足夠機(jī)械性質(zhì)、生物降解性、有效止血和身體愈合。
[0004] 氰基丙烯酸酯主要用于工業(yè)目的，且不超過5%用于醫(yī)療目的。然而，由于氰基丙 烯酸酯有替代縫合的可能性，因此研宄正在積極進(jìn)行中，尤其是在發(fā)達(dá)國家。然而，氰基丙 烯酸酯容易受到影響，施用后在耐熱性和耐水性上有惡化，并對一些組織保留了毒性和易 損性，因此，目前氰基丙烯酸酯是被限制性地使用。
[0005] 聚氨酯為保持附著區(qū)域的彈性的材料，且優(yōu)點(diǎn)在于由于與水的良好反應(yīng)性而快速 變硬，且變硬的材料保持了它的彈性。另一方面，聚氨酯的缺點(diǎn)在芳香二異氰酸酯是合成的 原料，是生物有毒的。
[0006] 使用明膠的膠為生物衍生的封閉劑，其實(shí)例為產(chǎn)品中明膠和間苯二酚經(jīng)福爾馬林 交聯(lián)的產(chǎn)品，以及使用明膠、聚谷氨酸和碳化二亞胺的產(chǎn)品。這些產(chǎn)品使用福爾馬林和碳化 二亞胺的化學(xué)交聯(lián)劑可以顯示出毒性。使用福爾馬林為交聯(lián)劑的產(chǎn)品已在一些國家中使 用，但其許可正在進(jìn)行中并且其效用正被日本等國測試。
[0007] 纖維蛋白膠為一種產(chǎn)品，該產(chǎn)品通過使用纖維蛋白原、凝血酶、氯化鈣等為材料應(yīng) 用纖維蛋白形成的原理而獲得。纖維蛋白膠具有快速黏著性，無需加熱和加壓，不受膠合區(qū) 域的環(huán)境的顯著影響，并且保持生物相容性和可生物降解的生物優(yōu)點(diǎn)。然而，當(dāng)與使用合成 材料的封閉劑相比時(shí)，纖維蛋白膠的缺點(diǎn)在于其缺乏物理性質(zhì)且具有相對較高的生物降解 速率。為了克服這些缺點(diǎn)，關(guān)于通過加入抑肽酶對纖維蛋白溶酶抑制以減緩纖維蛋白聚合 物的降解速率，并保留形狀的研宄正在進(jìn)行。使用膠原作為彌補(bǔ)這些缺點(diǎn)的添加劑將對補(bǔ) 充纖維蛋白膠配方做出顯著貢獻(xiàn)。
[0008] 用于纖維蛋白膠的纖維蛋白作為天然粘合劑或止血?jiǎng)┍粦?yīng)用和商業(yè)化，并且具有 生物相容性和生物降解性。已知纖維蛋白通常在傷口愈合的過程中于幾周內(nèi)被吸收而且沒 有例如炎癥、免疫應(yīng)答、組織壞死或纖維肥大的副作用。此外，纖維蛋白是對成纖母細(xì)胞的 天然支撐物（natural support)，并對傷口愈合起到非常重要的作用。纖維蛋白產(chǎn)品的概念 建立于20世紀(jì)70年代。最早的產(chǎn)品于1982年已在歐洲商業(yè)化，然后使用到現(xiàn)在。最近，許 多研宄中已證實(shí)纖維蛋白作為生物組織工程的支撐物，且已被應(yīng)用于各種領(lǐng)域，例如骨科、 牙科和神經(jīng)外科。
[0009] 可以用作添加劑以彌補(bǔ)纖維蛋白膠缺點(diǎn)的膠原為結(jié)構(gòu)蛋白成分。膠原構(gòu)成例如 真皮、肌腱/韌帶和血管的軟組織，以及例如骨骼和軟骨的硬組織，并且占到哺乳動(dòng)物中全 身蛋白含量的約1/3。已知超過二十種類型的膠原，并且構(gòu)成皮膚、肌腱/韌帶、骨骼等的 I型膠原占到體內(nèi)膠原的約90%。膠原是由三股（strands)螺旋構(gòu)成的蛋白且分子量為 300, 000道爾頓（每股約100, 000道爾頓）。在膠原（collage)中，為最小氨基酸單元（具 有最小的分子量）的甘氨酸被反復(fù)連接（-G X Y-;甘氨酸被連續(xù)重復(fù)，X和Y變化）。因此， 甘氨酸占到構(gòu)成膠原的氨基酸的約1/3。目前膠原已被用于在止血?jiǎng)?、傷口覆蓋劑、人造血 管、皺紋改善等領(lǐng)域的醫(yī)療目的。在用于止血?jiǎng)r(shí)，從小牛皮膚提取的膠原粉末產(chǎn)品Aviten 于1974年首次被開發(fā)并使用到現(xiàn)在。
[0010] 最重要的是，膠原在醫(yī)療再生領(lǐng)域使用的最重要的特征在于膠原是在人體組織中 生物兼容的材料，顯示出與細(xì)胞的親和性，因此對細(xì)胞的黏著和生長以及維持活力是重要 的。另外，膠原刺激包含在血液中的血小板以誘導(dǎo)包含在血小板中的生長因子，因此使損壞 的組織再生。而且，膠原具有三股螺旋結(jié)構(gòu)，而且與蛋白的單個(gè)結(jié)構(gòu)相比膠原可以相對保持 降解性，因此膠原可以在體內(nèi)用作支架（scaffold)。
[0011] 這樣的材料粘合可以基本保持組織封閉劑所需要具有的生物降解特性，并維持不 干擾再生的特性。而且，這樣的材料粘合可以補(bǔ)充纖維蛋白膠缺少的物理性質(zhì)，并減緩降解 速率，從而提供可降解再生骨骼。因此，除了作為簡單的封閉劑，該組織封閉劑會(huì)促進(jìn)組織 生成并加速再生程序以縮短治療過程。另外，為了立即使用該組織封閉劑，該組織封閉劑可 以是以預(yù)填充型和冷凍儲(chǔ)存安裝的制劑。
[0012] 組織封閉劑是一種產(chǎn)品，該產(chǎn)品可以減少病人在外科手術(shù)上的負(fù)擔(dān)，并最大化傷 口縫合和涂覆情況中的滿意度，例如與傳統(tǒng)方法相比疼痛和感染的風(fēng)險(xiǎn)更低并縮短手術(shù)時(shí) 間。所以，組織封閉劑在這種領(lǐng)域會(huì)受到高度青睞，且市場規(guī)模會(huì)逐漸擴(kuò)大。進(jìn)一步地，這 樣的產(chǎn)品有助于組織生成，并被用于藥物釋放體系和用于再生的支架，從而有助于再生醫(yī) 療領(lǐng)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 技術(shù)問題
[0014] (專利文件1)已提交了韓國專利公開號(hào)為2012-0125465 (專利申請?zhí)枮?2012-7018109,名稱：干粉纖維蛋白封閉劑）。
[0015] 因此，本發(fā)明已經(jīng)考慮到上述問題，本發(fā)明提供了一種將膠原和纖維蛋白混合的 組織封閉劑及其制備方法，其中，本發(fā)明的第一個(gè)目的是包括以下步驟：使用纖維蛋白原和 抑肽酶（aprotinin)混合第一材料；使用凝血酶、氯化鈣和膠原混合第二材料；以及將第一 材料和第二材料互相混合以制備第三材料；根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)目的，作為物理強(qiáng)度比較 的結(jié)果，可以確認(rèn)含有膠原的封閉劑顯示了高強(qiáng)度；根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)目的，作為長期/ 短期降解性測試的結(jié)果，可以確認(rèn)含有膠原的封閉劑顯示了低降解性；根據(jù)本發(fā)明的第四 個(gè)目的，通過電子顯微鏡觀察，可以確認(rèn)將膠原和纖維蛋白原結(jié)合以顯示穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)；根 據(jù)本發(fā)明的第五個(gè)目的，作為使用軟骨細(xì)胞、造骨細(xì)胞和脂肪來源細(xì)胞（adipose-derived cells)的生長和活力的比較結(jié)果，可以確認(rèn)含有膠原的結(jié)構(gòu)顯示了良好的生長速率和高生 存力；根據(jù)本發(fā)明的第六個(gè)目的，可以確認(rèn)膠原的內(nèi)含物維持了高強(qiáng)度和穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)并提 供了與細(xì)胞/血液具有親和性的材料，因此大大幫助了刪除/損壞區(qū)域的再生；本發(fā)明的第 七個(gè)目的是活化包含在血液中的血小板以誘導(dǎo)組織再生；以及本發(fā)明的第八個(gè)目的是顯著 改善產(chǎn)品的質(zhì)量和可靠性，從而滿足作為用戶的消費(fèi)者的各種需求，從而給予好印象。
[0016] 技術(shù)方案
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了制備將膠原和纖維蛋白混合的組織封閉劑的方 法，該方法包括：使用纖維蛋白原和抑肽酶混合第一材料；使用凝血酶、氯化鈣和膠原混合 第二材料；以及將第一材料和第二材料互相混合以制備第三材料。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種將膠原和纖維蛋白混合的組織封閉劑，該 組織封閉劑通過以下步驟制備：使用纖維蛋白原和抑肽酶混合第一材料；使用凝血酶、氯 化鈣和膠原混合第二材料；以及將第一材料和第二材料互相混合以制備第三材料。
[0019] 有益效果
[0020] 如上所述，本發(fā)明包括以下步驟：使用纖維蛋白原和抑肽酶混合第一材料；使用 凝血酶、氯化鈣和膠原混合第二材料；以及將第一材料和第二材料互相混合以制備第三材 料。
[0021] 根據(jù)具有前述技術(shù)特征的本發(fā)明，作為物理強(qiáng)度比較的結(jié)果，可以確認(rèn)含有膠原 的封閉劑顯示了高強(qiáng)度。
[0022] 另外，根據(jù)本發(fā)明，作為長期/短期降解性測試的結(jié)果，可以確認(rèn)含有膠原的封閉 劑顯示了低降解性。
[0023] 另外，根據(jù)本發(fā)明，通過電子顯微鏡觀察，可以確認(rèn)將膠原和纖維蛋白原結(jié)合以顯 示穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。
[0024] 另外，根據(jù)本發(fā)明，作為使用軟骨細(xì)胞、造骨細(xì)胞和脂肪來源細(xì)胞的生長和活力的 比較結(jié)果，可以確認(rèn)含有膠原的結(jié)構(gòu)顯示了良好的生長速率和高生存力。
[0025] 另外，根據(jù)本發(fā)明，可以確認(rèn)膠原的內(nèi)含物維持了高強(qiáng)度和穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)并提供了 與細(xì)胞/血液具有親和性的材料，因此大大幫組了刪除/損壞區(qū)域的再生。
[0026] 另外，本發(fā)明是活化包含在血液中的血小板以誘導(dǎo)組織再生。
[0027] 本發(fā)明通過前述效果能顯著改善產(chǎn)品的質(zhì)量和可靠性，從而滿足作為其用戶的消 費(fèi)者的各種需求，因此給予好印象，所以本發(fā)明非常有用的。
[0028] 下文中，結(jié)合附圖將詳細(xì)描述用于獲得以上效果的本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。
【附圖說明】
[0029] 圖1為根據(jù)本發(fā)明的將膠原和纖維蛋白混合的組織封閉劑的電子顯微鏡圖像 (20, 000X，臨界點(diǎn)干燥法）。
[0030] 圖2為顯示膠原與細(xì)胞粘合的概念圖。
[0031] 圖3為顯示膠原中血小板活化的概念圖。
[0032] 圖4為顯示了根據(jù)本發(fā)明的將膠原和纖維蛋白混合的組織封閉劑的降解速率的 比較曲線。
[0033] 圖5顯示了在根據(jù)