梯度的變化來(lái)進(jìn)行探宄。結(jié)果表明，程序化多 重靶向組裝體在生理pH7. 4條件下維持負(fù)電荷約為-12mV，在腫瘤細(xì)胞外環(huán)境pH6.8條 件下維持正電荷約為+8.0mV和溶酶體酸性pH5.0條件下維持較高正電荷約為+21. 5mV。 值得注意的是，隨著pH值的降低程序化多重靶向組裝體的粒徑在170nm- 260nm范圍內(nèi) 變大。這些表明隨著PH的降低，外圍馬來(lái)酸酐修飾基團(tuán)的離去，外圍氨基發(fā)生質(zhì)子化，結(jié)構(gòu) 變的疏松，利于藥物的釋放。
[0088] 實(shí)施例14:程序化多重靶向的兩親性樹狀大分子自組裝藥物遞送系統(tǒng)體外釋放 行為的研宄 精確稱取實(shí)施例8制備的程序化多重靶向的兩親性樹狀大分子自組裝載藥納米粒子 凍干樣溶解在pH7. 4、6. 8和5. 0的PBS中。分別將上述制備的溶液轉(zhuǎn)移到截留分子量為 1000的透析袋中，透析袋浸沒(méi)于含對(duì)應(yīng)pH值的25mLPBS中，PBS剩放于50mL的離心管 中。樣品置于搖床中并在37°C條件下孵育。在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)，取出ImL透析液用于分析， 并及時(shí)補(bǔ)充相應(yīng)PH值的新鮮PBS液。釋放的阿霉素用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)和發(fā) 射波長(zhǎng)分別為480nm和590nm。結(jié)果如圖10所示，程序化多重靶向自組裝載藥納米粒子 在pH7. 4和6. 8條件下25小時(shí)釋放在20%左右，但在pH5. 0酸性條件下2小時(shí)釋放量超 過(guò)50%。這說(shuō)明載藥納米粒子在pH7. 4和6. 8下能穩(wěn)定包裹疏水藥物而在pH5.0條件下 則能加速藥物的大量釋放。
[0089] 實(shí)施例15:程序化多重靶向的兩親性樹狀大分子自組裝藥物遞送系統(tǒng)細(xì)胞毒性 的研宄 4T1細(xì)胞培養(yǎng)在含10%血清和1%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基中，并在37°C條件下含5%CO2的培養(yǎng)箱中貼壁生長(zhǎng)。程序化多重靶向的兩親性樹狀大分子自組裝藥物遞送系統(tǒng)在不 同PH條件下對(duì)細(xì)胞的毒性用CCK-8實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定。具體步驟如下：收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞 用培養(yǎng)基稀釋成8XlO4cell/mL，每孔100yL接種到96孔板中并孵育24h。吸棄培養(yǎng) 基，加入含藥濃度從KT4到IO2Ug/mL的pH7. 4和6. 8(鹽酸調(diào)節(jié))培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24h。 吸棄培養(yǎng)基，每孔用PBS洗滌3次。緊接著每孔加入含10yLCCK-8試劑的無(wú)血清雙抗的 100UL的培養(yǎng)基，避光條件下在培養(yǎng)箱中孵育2h。每孔的吸光值用酶標(biāo)儀在450nm處進(jìn) 行測(cè)定。程序化多重靶向的樹狀大分子自組裝體在不同PH條件下對(duì)細(xì)胞的毒性根據(jù)上述 的方法進(jìn)行測(cè)定，濃度與上述材料濃度一一對(duì)應(yīng)。相對(duì)細(xì)胞存活率根據(jù)以下公式來(lái)計(jì)算：細(xì) 胞存活率=(OD實(shí)驗(yàn)組-OD背景）/(OD對(duì)照組-OD背景）X100%。細(xì)胞半數(shù)致死量（IC50)用EXCEL 軟件來(lái)計(jì)算。結(jié)果如圖11所示，首先，程序化多重靶向組裝體在高濃度下對(duì)細(xì)胞明顯無(wú)毒。 通過(guò)比較程序化多重靶向自組裝載藥粒子和電荷可調(diào)組裝體(無(wú)靶向）載藥粒子在不同pH 條件下的細(xì)胞毒性，發(fā)現(xiàn)低pH(6.8)明顯增大細(xì)胞毒性。通過(guò)比較程序化多重靶向自組裝 載藥粒子和電荷可調(diào)組裝體(無(wú)靶向)載藥粒子在相同pH條件下的細(xì)胞毒性，發(fā)現(xiàn)有靶向的 納米粒子具有較高的細(xì)胞毒性，同樣的現(xiàn)象也發(fā)生在表面正電荷有靶向自組裝體和表面正 電荷無(wú)靶向組裝體之間。這表明，PH的降低氨基的暴露使納米載體表面帶上正電荷有利于 正負(fù)電荷介導(dǎo)入胞，以及靶向的修飾有利于受體介導(dǎo)的入胞。值得注意的是，程序化多重靶 向自組裝載藥系統(tǒng)在PH6.8條件下IC50值比阿霉素對(duì)照組小了十倍多，并且和鹽酸阿霉 素陽(yáng)性對(duì)照組相當(dāng)。
[0090] 實(shí)施例16:程序化多重靶向的兩親性樹狀大分子自組裝藥物遞送系統(tǒng)入胞效果 的探宄 激光共聚焦定性分析：4T1細(xì)胞以IXIO4cells/well在薄底皿中貼壁生長(zhǎng)24h，其 中一個(gè)薄底皿的細(xì)胞在貼壁生長(zhǎng)12h后吸棄培養(yǎng)基，加入含PEG15citTbiotin濃度為10yg/ mL的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)孵育12h以飽和細(xì)胞膜表面生物素受體。吸棄培養(yǎng)基，換加含載藥 納米粒子的pH7. 4和6. 8 (鹽酸調(diào)節(jié))新鮮培養(yǎng)基，其中阿霉素濃度統(tǒng)一為10yg/mL。在 37°C條件下孵育3h后，小心地吸棄培養(yǎng)基，加入含Hoechst33342的培養(yǎng)基繼續(xù)孵育30 min。吸棄培養(yǎng)基，用PBS洗滌3遍后加入300yL的PBS，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。激 光共聚焦圖片直觀清楚的表明含有電荷可調(diào)組裝體（自組裝基元一）成分的載藥納米粒子 在pH6. 8弱酸性條件下能轉(zhuǎn)運(yùn)較多的阿霉素到細(xì)胞內(nèi)，而且程序化多重靶向載藥納米粒 子在3小時(shí)內(nèi)能把阿霉素轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中（紅色和藍(lán)色熒光重疊)發(fā)揮抗腫瘤作用。這種現(xiàn) 象在其它含有電荷可調(diào)組裝體成分的組中都能觀察到，基于我們小組以前的研宄，賴氨酸 富裕的超分子納米載體能夠逃逸溶酶體并傳遞藥物到細(xì)胞核中。
[0091] 流式細(xì)胞儀定量分析：4T1細(xì)胞以3XIO5cells/well在6孔板中貼壁生長(zhǎng)24 h，其中一個(gè)孔板的3個(gè)孔的細(xì)胞在貼壁生長(zhǎng)12h后吸棄培養(yǎng)基，加入含PEG15tltTbiotin濃 度為10Ug/mL的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)孵育12h以飽和細(xì)胞膜表面生物素受體。吸棄培養(yǎng)基， 換加含載藥納米粒子的pH7. 4和6. 8 (鹽酸調(diào)節(jié)）新鮮培養(yǎng)基，其中阿霉素濃度統(tǒng)一為10 yg/mL。在37°C條件下孵育3h后，吸棄培養(yǎng)基，用PBS洗3遍。胰酶消化培養(yǎng)基吹打后 離心（1000rpm，5min),沉淀重新混懸在300yL的PBS中。固定激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為 480nm和590nm，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞攝取量的測(cè)定，結(jié)果用WinMDI2. 9軟件來(lái)分析。 結(jié)果如圖12所示，定量的流式細(xì)胞儀分析結(jié)果和定性的激光共聚焦結(jié)果一致。
[0092] 實(shí)施例17:程序化多重靶向的兩親性樹狀大分子自組裝藥物遞送系統(tǒng)胞內(nèi)遞送 的追蹤 材料標(biāo)記FITC:精確稱取實(shí)施例7制備的程序化多重靶向的兩親性樹狀大分子自組裝 體凍干樣50. 0mg溶解在10mL的pH9. 4去離子水中。精確稱取5. 0mg的FITC加入上 述溶液中，避光過(guò)夜攪拌。反應(yīng)液在4°C條件下在截留分子量為1000的透析袋中透析3天。 外相用新鮮的pH7. 4的去離子水每4小時(shí)更換一次，充分移除未反應(yīng)的TITC。透析液凍干 后得到黃色固體產(chǎn)物。
[0093] 4T1細(xì)胞以IXIO4cells/well在薄底皿中貼壁生長(zhǎng)24h。吸棄培養(yǎng)基，加入含 FITC標(biāo)記的載藥納米粒子新鮮的pH6. 8 (鹽酸調(diào)節(jié)）的培養(yǎng)基，其中阿霉素濃度為5yg/ mL。分別在孵育1、3和6h后，小心地吸棄培養(yǎng)基，加入含LysoTrackerBlueDND-22的培 養(yǎng)基。孵育30min后，用PBS洗滌3遍，并最終加入300yL的PBS覆蓋薄底皿。在激光 共聚焦顯微鏡下觀察，經(jīng)過(guò)一小時(shí)的孵育FITC標(biāo)記的程序化多重靶向的載藥納米粒子主 要黏附在細(xì)胞膜上。經(jīng)過(guò)3小時(shí)的孵育，載藥納米粒子被截留在酸性細(xì)胞器(溶酶體和內(nèi)涵 體)中（綠色、紅色和藍(lán)色熒光的疊加)。幸運(yùn)的是，經(jīng)過(guò)6小時(shí)的孵育，阿霉素從溶酶體中逃 逸出來(lái)進(jìn)入細(xì)胞核中（紅色、綠色和藍(lán)色熒光分開)。這和實(shí)施例16所述現(xiàn)象一致，細(xì)胞內(nèi) 追蹤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，氨基暴露的納米粒子在酸性條件下具有較高的電位能緩沖溶酶體低 的酸性，發(fā)生溶酶體逃逸。
[0094] 實(shí)施例18:程序化多重靶向的兩親性樹狀大分子自組裝體抗蛋白吸附的研宄 首先，精確稱取實(shí)施例7制備的程序化多重靶向的兩親性樹狀大分子自組裝體凍干 樣，分別溶解在pH7. 4和6.8 (用鹽酸調(diào)節(jié))的水中，濃度為0.1mg/mL。然后，精確稱取牛 血清蛋白BSA，將其溶解在pH7. 4和6. 8 (用鹽酸調(diào)節(jié))的水中制備濃度為0.Img/mL的溶 液。將相同pH的樣品溶液和BSA溶液等體積混合，在37°C下的搖床孵育。在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn) (2min、30min、Ih、6h和12h)，從中取出一小份在轉(zhuǎn)速8000g下離心15min沉淀BSA 結(jié)合物。上清液BSA量用紫外可見分光光度計(jì)在280nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收，而沉淀的BSA量 用預(yù)先測(cè)定的標(biāo)曲進(jìn)行計(jì)算。作為對(duì)照，端基未功能化修飾的兩親性樹狀大分子組裝體和 丁二酸酐修飾的兩親性樹狀大分子組裝體分別作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照用于蛋白吸附行為的 研宄。結(jié)果如圖13所示，不管在pH7.4還是6.8條件下，表面負(fù)電荷靶向組裝體都具有很 少的蛋白吸附，而表面正電荷靶向組裝體具有明顯的蛋白吸附。然而。程序化多重靶向組 裝體在pH7. 4有很少的蛋白吸附，在pH6. 8微酸性條件下蛋白吸附明顯增大。這說(shuō)明弱 酸性pH6. 8條件會(huì)促使程序化多重靶向組裝體表面電荷的快速反轉(zhuǎn)，進(jìn)而增大對(duì)牛血清 蛋白的吸附作用。
[0095] 實(shí)施例19:程序化多重靶向的兩親性樹狀大分子自組裝藥物遞送系統(tǒng)體內(nèi)藥代 動(dòng)力學(xué)行為的研宄 動(dòng)物的飼養(yǎng)：所有的動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)開始前一周提前購(gòu)買使適應(yīng)環(huán)境。所有的動(dòng)物在25°C條件下在55%的濕度下和水源食物易得的條件下飼養(yǎng)。所有的動(dòng)物操作符合四川大學(xué)有關(guān) 動(dòng)物飼養(yǎng)規(guī)范管理?xiàng)l例的規(guī)定。
[0096] 將載藥納米粒子溶解在生理鹽水中，通過(guò)小鼠尾靜脈以10mg阿霉素每公斤小鼠 的劑量注射200yL的上述載藥納米粒子溶液。每組為3只BALB/c小鼠。在給藥后2min， 30min，Ih，6h和12h的時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)小鼠眼球取血將血液樣品收集于含肝素鈉的采 血管中。將此血液樣品在4°C條件下在3000g的轉(zhuǎn)速下離心10min。從中取出100yL 的血漿并將其加入到50yL的5MHCl中，在50°C條件下孵育1.5h。待樣品冷卻到室溫 后，加入50yLIM的NaOH。緊接著將此混合液用500yL的氯仿/異丙醇混合溶劑(體 積比4:1)渦旋混合90s后萃取。在10000g的轉(zhuǎn)速下離心5min后，收集有機(jī)相，過(guò)夜減 壓揮干有機(jī)相。將殘?jiān)苡?00UL的乙腈中。在10000g的轉(zhuǎn)速下離心5min后，上清 液用于HPLC的分析。通過(guò)在血液樣品（未治療小鼠組眼球取血）中直接添加不同濃度的鹽 酸阿霉素，接著并按上述操作來(lái)制定阿霉素在血液中的標(biāo)準(zhǔn)吸收曲線。結(jié)果如圖14所示， 藥動(dòng)學(xué)曲線表明藥物遞送系統(tǒng)能明顯增加抗腫瘤藥物阿霉素的半衰期，延長(zhǎng)在血液中的滯 留時(shí)間，而程序化多重靶向載藥納米粒子具有最大半衰期和最高的延長(zhǎng)作用。這些結(jié)果表 明表面負(fù)電荷的納米粒子具備穩(wěn)定的隱蔽層的確能增加血液中循環(huán)時(shí)間。
[0097] 實(shí)施例20:程序化多重靶向的兩親性樹狀大分子自組裝藥物遞送系統(tǒng)活體成像 的研宄通過(guò)BALB/c裸鼠右腋窩皮下注射IO6個(gè)4T1細(xì)胞建立外源性腫瘤模型。當(dāng)接種的 腫瘤體積長(zhǎng)到100mm3時(shí)，12只小鼠被隨機(jī)的分成4組。通過(guò)小鼠尾靜脈以5mg阿霉素每 公斤小鼠的劑量注射100UL的載藥納米粒子的生理鹽水溶液。在給藥后Ih，6h和12 h的時(shí)間點(diǎn)，用水合氯醛將小鼠麻醉用于活體成像的研宄。用體內(nèi)活體成像系統(tǒng)檢測(cè)熒光信 號(hào)，固定激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為450nm和605nm。為了進(jìn)一步評(píng)估藥物的組織分布，小鼠 在給藥24h后犧牲。剝離心肝脾肺腎和腫瘤，用生理鹽水洗滌數(shù)次后用于藥物組織分布的 半定量的分析。通過(guò)比較定位于腫瘤部位的直觀熒光強(qiáng)度表明納米載體載藥系統(tǒng)具有明顯 高于游離藥物的EPR效應(yīng)，而程序化多重靶向藥物遞送系統(tǒng)具有面積最大熒光最強(qiáng)的藥物 腫瘤定位，這一結(jié)果與前面的藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)論相符合。
[0098] 實(shí)施例21:程序化多重靶向的樹狀大分子自組裝藥物遞送系統(tǒng)抗腫瘤效果的研 宄通過(guò)BALB/c小鼠右翼皮下注射5XIO5個(gè)4T1細(xì)胞建立外源性腫瘤模型。當(dāng)接種的腫 瘤體積長(zhǎng)到100 _3時(shí)，36只小鼠被隨機(jī)的分成6組。通過(guò)小鼠尾靜脈以5mg阿霉素每 公斤小鼠的劑量注射200yL的載藥納米粒子的生理鹽水溶液，每3天一次持續(xù)18天。在 每次給藥前用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小，腫瘤體積根據(jù)下面公式進(jìn)行計(jì)算：腫瘤體積=長(zhǎng)X 寬2/2,相對(duì)腫瘤體積根據(jù)下面公式進(jìn)行計(jì)算：相對(duì)腫瘤體積=(每次測(cè)量的腫瘤體積-最 開始測(cè)量的腫瘤體積)/最開始測(cè)量的腫瘤體積。小鼠相對(duì)體重根據(jù)下面公式進(jìn)行計(jì)算：相 對(duì)體重=(每次測(cè)量的小鼠體重-最開始測(cè)量的小鼠體重）/最開始測(cè)量的小鼠體重。